PCR de fusion à haute résolution pour déterminer les variations de séquence dans les séquences d’ADN mutant

Résumé

Source : Kisserli, A., et al. PCR de fusion à haute résolution pour le génotypage du polymorphisme de longueur du récepteur du complément 1 : un outil innovant pour l'évaluation de la susceptibilité aux gènes de la maladie d'Alzheimer. J. Vis. Exp. (2017).

Dans cette vidéo, nous décrivons une technique de PCR de fusion à haute résolution pour déterminer le polymorphisme de longueur de fragments d’ADN de différentes longueurs de séquence, sur la base de l’analyse de la température de fusion.

Protocole

1. Protocole HRM-PCR

1. Décongeler les échantillons d’ADN. Diluer les échantillons d’ADN dans des tubes de 1,5 mL avec de l’eau pour les ajuster à une concentration de 10 ng/μL
   note: Le volume total d’ADN dilué doit être compris entre 2 μL et 10 μL.
2. Décongelez les solutions d’amorçage. Diluer les solutions d’amorçage dans des tubes de 1,5 mL avec de l’eau pour les ajuster à la même concentration de 6 μM.
   note: Les séquences d’amorces et les conditions de réaction sont fournies dans le tableau 1.
3. Décongelez les solutions de kits HRM-PCR et mélangez soigneusement par vortex pour assurer la récupération de tout le contenu. Faites tourner brièvement les trois flacons contenant le mélange enzymatique avec le colorant de liaison à l’ADN, le MgCl₂, et l’eau dans une microcentrifugeuse avant de les ouvrir. Conservez-les à température ambiante.
4. Dans un tube de 1,5 mL à température ambiante, préparez le mélange de PCR pour une réaction de 20 μL en ajoutant les composants suivants dans l’ordre indiqué ci-dessous :
   1. 10 μL de mélange enzymatique avec colorant de liaison à l’ADN ;
   2. 2 μL de 25 mM MgCl₂ ;
   3. 1 μL d’amorce 1,6 μM (concentration finale : 300 nM) ;
   4. 1 μL d’amorce 2,6 μM (concentration finale : 300 nM) ; et
   5. 5 μL d’eau.
      note: Pour préparer le mélange de PCR pour plus d’une réaction, multipliez les volumes ci-dessus par le nombre de réactions à exécuter, plus une réaction supplémentaire.
5. Mélanger soigneusement par vortex.
6. Pipeter 19 μL de mélange PCR, préparé ci-dessus, dans chaque puits d’une plaque multipuits blanche.
7. Ajouter 1 μL de matrice d’ADN ajustée en fonction de la concentration.
   note: Pour les réactions de contrôle, exécutez toujours un contrôle négatif avec les échantillons. Pour préparer un contrôle négatif, remplacez l’ADN matrice par de l’eau.
8. Scellez la plaque multipuits blanche avec une feuille d’étanchéité.
9. Placez la plaque multipuits blanche dans la centrifugeuse et équilibrez-la à l’aide d’un contrepoids approprié (c’est-à-dire une autre plaque multipuits). Centrifugeuse pendant 1 min à 1 500 x g dans une centrifugeuse à godet oscillant standard contenant un rotor pour plaques multipuits avec des adaptateurs appropriés.
10. Chargez la plaque multipuits blanche dans l’instrument HRM-PCR.
11. Démarrez le programme HRM-PCR avec les conditions PCR suivantes :
    Dénaturation : 95 °C pendant 10 min ; 1 cycle.
    Amplification : 95 °C pendant 10 s, 62 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 20 s ; 47 cycles.
    Courbe de fusion : 95 °C ; taux de rampe : 0,02 °C/s ; 25 acquisitions par °C ; 1 cycle.
    Refroidissement : 40 °C pendant 30 s ; taux de rampe 2,2 °C/s ; 1 cycle.

Tableau 1 : Amorces et paramètres utilisés dans l’analyse de fusion à haute résolution.

2. Analyse HRM pour déterminer le polymorphisme de longueur CR1

REMARQUE : La méthodologie décrite (Figure 1) est spécifique à notre logiciel (voir le tableau des matériaux), bien que d’autres progiciels puissent être utilisés.

1. Ouvrez un logiciel de balayage génétique pour effectuer l’analyse de balayage de polymorphisme de longueur CR1.
2. Ouvrez l’expérience contenant le programme d’amplification et le programme de courbe de fusion.
3. Cliquez sur Éditeur d’échantillons dans la barre de module, puis sélectionnez le flux de travail de numérisation.
4. Définir les propriétés des échantillons (c.-à-d. nom, témoin inconnu ou négatif).
5. Cliquez sur Analyse dans la barre du module.
6. Dans la liste Créer une analyse, sélectionnez Balayage génétique.
7. Cliquez sur l’onglet Normalisation pour normaliser les courbes de fusion.
8. Cliquez sur l’onglet Décalage de température pour réinitialiser l’axe de température (axe x) des courbes de fusion.
   note: Le graphique du bas montre les courbes de fusion qui sont à la fois normalisées et décalées en température.
9. Cliquez sur le bouton Calculer pour analyser les résultats et déterminer le regroupement.
10. Cliquez sur l’onglet Graphique des différences dans la zone des graphiques pour afficher les courbes de fusion normalisées et décalées et le graphique des différences normalisées et décalées de température.

Résultats

Figure 1 : Captures d’écran de l’interface graphique du logiciel utilisé à l’étape 2 du protocole. (A) Ouvrez le logiciel de numérisation génétique. (B) Programme d’amplification et programme de courbe de fusion. (C) Cliquez sur Éditeur d’échantillons dans la barre du module. (d) Sélectionnez Numérisation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Blouse			protection
SensiCareGants d’examen en nitrile non poudrés	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, États-Unis	486802	Protection des échantillons
Pipette Eppendorf Reference 2, 0,5-10μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000024	Pipetage d’échantillons
Pipette Eppendorf Reference 2, 20-100μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000059	Pipetage d’échantillons
Pipette Eppendorf Reference 2, 100-1000μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000083	Pipetage d’échantillons
TipOne 10μL Gradué, embout filtrant	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Allemagne	Réf. S1121-3810	Pipetage d’échantillons
TipOne 1-100μL biseauté, pointe filtre	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Allemagne	S1120-1840	Pipetage d’échantillons
Pointe barrière ART 1000E	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	2079E	Pipetage d’échantillons
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 ml, qualité Eppendorf	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	30120086	mélanger
Vortex-Génie 2	Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, États-Unis	SI-0236	mélanger
Centrifugeuse Mikro 200	Hettich Zentrifugen, D-78532, Allemagne	Référence 0002020-02-00	centrifugation
Multipette E3	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4987000010	distribution
Light Cycler 480 plaque multipuits 96, blanc	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Allemagne	4729692001	Lieu de réaction
Film d’étanchéité Light Cycler 480	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Allemagne	4429757001	couverture
LightCycler 480 Instrument II, 96 puits	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Allemagne	05015278001	Réaction en chaîne par polymérase fondue à haute résolution
Centrifugeuse Heraeus Megafuge 11R	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	75004412	centrifugation
LightCycler 480 Maître de fusion haute résolution	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Allemagne	04909631001	réactifs de réaction
Apprêt CN3 : 5'ggccttagacttctcctgc 3'	Eurogentec Division Produits Biologiques, B4102 Seraing, Belgique		réactif de réaction
Apprêt CN3re : 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'	Eurogentec Division Produits Biologiques, B4102 Seraing, Belgique		réactifs de réaction
light cycler 480 SW 1.5.1 logiciel	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Allemagne		logiciel utilisé pour l’analyse des données de polymorphisme HRM-PCR CR1