Réaction en chaîne par polymérase multiplex pour détecter la méthylation de l’ADN dans les leucocytes

Résumé

Source : Malic, L., et al. PCR de gouttelettes multiplexes spécifiques à la méthylation à l’aide d’un dispositif générateur de gouttelettes de polymère pour le diagnostic hématologique.J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente la technique d’amplification en chaîne par polymérase multiplex pour la quantification simultanée de régions d’ADN méthylées dans différentes populations de globules blancs en tant que biomarqueur précoce pour le diagnostic clinique et le pronostic.

Protocole

1. Génération de gouttelettes et PCR

REMARQUE : Le tableau 1 présente des informations sur les amorces avant et arrière ainsi que sur les sondes d’hydrolyse à double trempe pour les gènes C-LESS, CD3Z et Foxp3, qui sont nécessaires à l’amplification multiplex des cibles de gènes déméthylés.

1. Préparez le mélange maître comme décrit dans le tableau 2.
2. Décongeler tous les composants du mélange maître, à l’exception du mélange d’enzymes. Mélangez soigneusement le mélange principal en pipetant de haut en bas et tournez brièvement vers le bas.
3. Ajouter le volume approprié (1 μL) d’ADN converti au bisulfite dans le mélange maître dans un tube PCR. Mélangez la réaction en pipetant de haut en bas et tournez brièvement vers le bas.
4. Connectez la tubulure fluidique jetable (D.E. 0,25 mm, D.E. 1,6 mm) à deux seringues en verre de précision (volume de 250 μL) à l’aide de raccords PEEK.
5. Préremplissez une seringue en verre de précision avec 250 μL d’huile de support contenant 5 % de tensioactif fluoré.
6. Préremplissez une autre seringue en verre de précision avec 50 μL d’huile de support avant de charger 100 μL du mélange PCR pour assurer la distribution de tout le volume de l’échantillon pendant l’émulsification.
7. Installez un dispositif microfluidique de gouttelettes sur une platine d’un microscope optique droit équipé d’une caméra à haute vitesse pour observer et enregistrer la formation des gouttelettes en temps réel.
8. Placez les seringues préremplies sur le pousse-seringue programmable et, à l’aide du raccord PEEK avec raccords (voir tableau des matériaux), connectez le tube des seringues au tube des canaux d’entrée respectifs du dispositif microfluidique à gouttelettes.
9. Placez le tube de la sortie du générateur de gouttelettes à l’intérieur d’un tube PCR de 0,5 ml.
10. Ajustez le débit du pousse-seringue à 2 μL/min et laissez la taille des gouttelettes se stabiliser avant de recueillir l’émulsion résultante.
11. Prélever l’émulsion et transférer 75 μL dans un tube PCR de 0,2 mL pour le cycle thermique.
12. Assurez-vous que la teneur en huile dans le tube PCR correspond étroitement au volume de la phase dispersée afin d’éviter la coalescence des gouttelettes pendant le cycle thermique.
13. Placez le tube PCR de 0,2 mL dans un thermocycleur et effectuez le protocole de cyclage comme suit : préchauffage à 95 °C pendant 5 min, puis 45 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s, et recuit/extension à 60 °C pendant 30 s.

Tableau 1 : Conception de l’amorce et de la sonde d’hydrolyse.

FOXP3 Vers l’avant	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 Inversé	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z Forward	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z Inversé	CAA, AAA, CTC, CT, TTC, TCC, TAA, CCA
C-LESS Vers l’avant	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS Inversé	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
Sonde FOXP3	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
Sonde CDZ3	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
Sonde sans C	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Tableau 2 : Recette du mélange principal pour la mdPCR.

Réactif	Solution mère	Volume de mixage principal	Concentration de travail
Tris-HCl	1 M	2 μL	20 millions d’euros
Kcl	1 M	10 μL	100 millions d’euros
MgCl2	25 millions d’euros	16 μL	4 millions d’euros
Apprêts C-LESS	10 μM	10 μL	1 μM chacun
Amorces CD3Z	10 μM	10 μL	1 μM chacun
Apprêts FOXP3	10 μM	10 μL	1 μM chacun
Sonde C-LESS	10 μM	5 μL	500 nM
Sonde CD3Z	10 μM	5 μL	500 nM
Sonde FOXP3	10 μM	5 μL	500 nM
ADN polymérase HotStarTaq	5 unités/μL	8 μL	0,4 unités/μL
Cible d’ADN traitée au bisulfite	variable	variable	variable
Eau sans nucléases		variable
Volume total		100 μL

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube PCR	Bio-Rad, Mississauga, Ont.	TFI0201
Tensioactif fluoré	RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-Tensioactif fluoré
Tubes fluidiques jetables	dolomite	3200063
Tubes fluidiques jetables	dolomite	3200302
Raccords PEEK	IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA	P-881
Huile de support	3M, St Paul, Minnesota
Microscope optique droit	Nikon, Melville, État de New York