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1. Contrôle de la qualité de l’ADN génomique
REMARQUE : L’ADN génomique (ADNg) a été extrait du sang périphérique à l’aide de la méthode bien établie de purification de l’ADN à base de membrane de silice. Avant les procédures ci-dessous, la concentration d’ADNg a été déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Préparez l’échantillon d’ADNg à une concentration de 10 à 100 ng/μL.
- Ajoutez 10 μL de tampon d’échantillon d’ADN dans une bandelette de 8 tubes.
- Ajoutez 1 μL d’échelle d’ADN ou d’ADNg dans les tubes. Agitez le mélange pendant 1 min à l’aide de la microplaque.
- Chargez le tube, le dispositif à gel et les pointes de pipette dans l'instrument d'électrophorèse (table des matériaux) et démarrez le cycle en appuyant sur le bouton 'Start'.
note: Le système d’électrophorèse fonctionnera automatiquement en un clic sur le bouton Démarrer.
- Confirmez que le marqueur inférieur contenu dans le tampon d’échantillon d’ADN est correctement attribué sur les électrophérogrammes. S'il n'est pas correctement attribué, attribuez manuellement le marqueur dans le 'Mode Électrohérogramme' du logiciel.
note: Le numéro d’intégrité de l’ADN (DIN) sera calculé automatiquement. La valeur DIN provient de l’intégrité de l’ADN. Des valeurs DIN élevées et faibles indiquent respectivement un ADNg très intact et un ADNg fortement dégradé.
- Spécifiez la région de taille de l'ADNg (> 200 pb) dans le « Mode Région » du logiciel pour calculer automatiquement la concentration d'ADNg (> 200 pb).
2. Conception de l’amorce et de la sonde
- Calculez les valeurs de température de fusion (Tm) à l’aide d’un outil en libre accès dans les conditions suivantes : 10-25 bases, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTP et 3 mM Mg2+ (table des matériaux). Concevoir les amorces avant et inverse pour amplifier la région génomique contenant les allèles cibles avec une valeur Tm d’environ 60 °C et une longueur d’amplicon de 100 à 300 pb.
REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la concentration des oligonucléotides.
- Concevoir les sondes d’acide nucléique verrouillé (LNA) pour les allèles de référence et les allèles variants en fonction des conditions suivantes : (i) 1 à 6 LNA sont présents dans chaque sonde ; (ii) un colorant fluorescent et un extincteur sont présents aux extrémités 5' et 3' de chaque sonde, respectivement ; iii) la différence entre les valeurs Tm des sondes appariées et des sondes non appariées est > 10 °C ; (iv) Les valeurs Tm des sondes appariées et non appariées sont supérieures et inférieures à celles des amorces, respectivement [par exemple, amorce directe : 60,8 °C, amorce inverse : 59,8 °C, sonde d’allèle de référence (appariée/non appariée) : 62,6/45,3 °C, sonde d’allèle variant (appariée/inadaptée) : 61,7/50,5 °C]. Les valeurs Tm ont été calculées à l’aide de l’outil en libre accès également utilisé pour l’étape 2.1.
- S’assurer que les amorces et les sondes conçues n’englobent pas les polymorphismes mononucléotidiques avec une fréquence de > 0,1 %, déterminée à partir de bases de données [p. ex., la base de données sur les polymorphismes mononucléotidiques (dbSNP)].
3. PCR numérique
- Préparez les amorces, les sondes et les solutions mères d’ADNg aux concentrations décrites dans le tableau 1 avec un tampon TE et stockez-les à -20–4 °C.
- Mélanger les réactifs à température ambiante dans un volume total de 15 μL jusqu’à la concentration finale décrite dans le tableau 1.
- Ajouter 3 μL d’eau distillée au lieu d’ADNg dans un témoin sans matrice (NTC).
- Préparez 3,5 fois la quantité de mélange PCR en trois exemplaires pour tenir compte de l’erreur de pipetage.
- Pipetez le mélange PCR de haut en bas pour le mélanger.
- Placez la plate-forme de chargement sur les copeaux intégrés dans la bande de 8 tubes et placez-les sur le chargeur automatique. Assurez-vous qu’il y a un contact entre le copeau et la plate-forme de chargement.
- Installez un curseur de chargement sur la plate-forme et maintenez le curseur avec la butée du chargeur.
- Pipette 15 μL du mélange PCR sur la plate-forme près de l’extrémité du curseur (Figure 1A).
- Faites fonctionner le chargeur en appuyant sur le bouton du chargeur (pendant environ 1 min).
note: Ce n’est pas un problème s’il reste une petite quantité de mélange PCR sur la plateforme. Il est possible de relancer séquentiellement le chargeur.
- Placez le chip-in-a-tube rempli du mélange PCR dans la fente latérale de l’activateur d’étanchéité. Poussez le couvercle coulissant et le bord du capot supérieur pour ne pas casser l’éclat (Figure 1B).
- Faites fonctionner l’activateur d’étanchéité (environ 2 min). Répétez séquentiellement l’activateur d’étanchéité pendant 1 min si une flaque de liquide est encore visible parce qu’une étanchéité incomplète provoque une contamination croisée des signaux positifs (figures 1C et 1D).
- Ajouter 230 μL de liquide d’étanchéité, un réactif à base d’huile, dans les tubes.
note: Les copeaux doivent maintenant être immergés dans le fluide.
- Placez les tubes dans le thermocycleur. Faites fonctionner le thermocycleur comme décrit dans le tableau 2 (pendant environ 2 h). Réglez la température ou la durée de la PCR s’il y a une distribution inégale des partitions positives (Figure 1E).
REMARQUE : Il est recommandé de régler la vitesse de rampe à environ 1 °C/s.
- Laissez les tubes dans le thermocycleur pendant au moins 15 min pour réduire le bruit de base.
note: Les tubes peuvent également être laissés toute la nuit. Des signaux de fluorescence ont été détectés même le lendemain.
- Placez les tubes sur le gabarit de détection et versez 6 ml d’eau distillée dans le gabarit. Si des bulles d’air sont visibles à l’intérieur et à l’extérieur des tubes, éliminez-les (figures 1F et 1G).
- Chargez le gabarit dans le détecteur et exécutez-le en cliquant sur le bouton 'Exécuter' du logiciel après avoir sélectionné les onglets Fluorescence, Expérience et Échantillon/NTC (Table des matériaux).
REMARQUE : La détection bicolore de huit échantillons avec une intensité par défaut prend environ 4 à 5 min.
- Confirmez le diagramme de position, l’histogramme et le nuage de points 2D.
REMARQUE : Si l’intensité de fluorescence des partitions négatives est élevée, ajustez l’intensité en cliquant sur le bouton Paramètres du logiciel afin qu’elle se situe dans la plage de 30 à 70.
- Calculez la fraction allélique variant (VAF) à l’aide de la formule suivante :
4. Collecte du produit PCR
- Retirez le liquide d’étanchéité du tube.
- Ajoutez 100 μL de tampon TE dans le tube. Agitez vigoureusement pendant 30 secondes et centrifugez brièvement le tube.
- Transférez la solution d’ÉT dans un autre tube et ajoutez 30 μL d’acétate de sodium 3M et 200 μL d’éthanol.
- Refroidissez la solution à -20 °C pendant la nuit.
- Centrifuger la solution pendant 30 min à 16 000 x g et retirer le surnageant.
- Ajoutez 300 μL d’éthanol à 80 % dans le tube et vortex.
- Centrifuger la solution pendant 15 min à 16 000 x g et retirer le surnageant. Laissez le précipité sécher à l’air libre pendant 5 min.
- Dissoudre le précipité dans 1 à 5 μL de tampon TE après séchage à l’air.
- Si nécessaire, évaluer la taille du produit à l’aide d’un appareil d’électrophorèse en se référant à l’étape 1. Chargez 1 μL de la solution sur le dispositif à gel pour une sensibilité élevée (Tableau des matériaux).
