$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
REMARQUE : Cette procédure est spécialement conçue pour la détection d’un faible nombre de molécules d’ADNc dans des tissus humains fraîchement congelés. Les coupes de tissus ont été découpées sur de la glace sèche, alors qu’elles étaient encore congelées, à partir d’échantillons de tumeurs gastriques ou de tissus normaux précédemment validés par des patients.
1. Isolement et purification de l’ARN
- Extraction d’ARN
note: L’isolement de l’ARN s’effectue sous le capot à l’aide d’un produit spécifique (voir Tableau des matériaux). Cependant, une variété de kits d’isolement sont disponibles dans le commerce.
- Homogénéiser 50 à 100 mg d’un échantillon de tissu fraîchement congelé finement coupé dans un tube de 1,5 mL avec 1 mL de réactif d’isolement de l’ARN et agiter vigoureusement pendant 15 s. Incuber les tubes à -80 °C pendant la nuit.
- Incuber le tube contenant l’échantillon à température ambiante pendant 5 min et mélanger par vortex pendant 15 s.
- Gardez le tube sur de la glace, ajoutez 200 μL de chloroforme et agitez vigoureusement pendant 15 s.
- Incuber les tubes à température ambiante pendant 60 s et les centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Transférez la phase aqueuse dans un tube de 1,5 mL et ajoutez 20 μg de glycogène.
note: Il est important d’éviter soigneusement de transférer l’une des couches interphasiques ou organiques afin de réduire la contamination.
- Ajouter 500 μL d’isopropanol, en inversant le tube pour mélanger, et incuber sur glace pendant 10 min.
- Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour précipiter l’ARN.
note: L’ARN sera présent dans une pastille gélatineuse sur le côté et le fond du tube, souvent invisible après centrifugation.
- Retirer le surnageant sans perturber le précipité et le laver avec 1 mL d’éthanol à 75 % par pipetage.
- Centrifugez le tube à 7 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirez le surnageant sans déranger la pastille.
- Laissez sécher la pastille jusqu’à ce que le précipité devienne transparent et dissolvez-la dans 50 μL d’eau sans RNase.
- Congeler les échantillons à -80 °C au moins une nuit avant de les quantifier.
- Élimination de l’ADN génomique et purification de l’ARN
note: Une étape de digestion de la DNase, suivie d’une purification de l’ARN sur colonne, est recommandée pour l’analyse de cibles de faible abondance afin de digérer l’ADN contaminant.
- Dissoudre la DNase I lyophilisée (1 500 unités de Kunitz) dans 550 μL d’eau exempte de RNase à l’aide d’une seringue, mélanger doucement en inversant le flacon et diviser la solution mère reconstituée en aliquotes.
- Transvaser dans un tube de 1,5 mL le volume calculé de l’échantillon avec 15 μg d’ARN, 10 μL de tampon de digestion DNase de la trousse (indiqué dans le tableau des matières), 2,5 μL de solution mère de DNase I et de l’eau exempte de RNase à 100 μL. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Ajouter 350 μL de tampon de lyse tissulaire (du kit, voir la table des matériaux) et mélanger par pipetage.
- Ajouter 250 μL d’éthanol à 100 % et mélanger par pipetage.
- Transférez tout le volume (700 μL) dans une nouvelle colonne de centrifugation et centrifugez à 12 000 x g pendant 15 s.
- Transférez le filtre dans un nouveau tube de collecte, ajoutez 500 μL d’éthanol à 80 % dans la colonne et centrifugez à 12 000 x g pendant 2 min.
- Ouvrez le couvercle de la colonne d’essorage et centrifugez à 12 000 x g pendant 5 min avec un nouveau tube de collecte pour sécher le filtre, puis transférez le filtre dans un tube de 1,5 ml.
- Ajouter 14 μL d’eau exempte de RNase directement dans la colonne de filtration et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min.
- Conservez les échantillons sur de la glace et procédez à la quantification à l’aide de 2 μL de l’échantillon sur un spectrophotomètre de paillasse ou stockez l’ARN à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
2. Configuration de la réaction PCR numérique
- Mélange réactionnel dPCR et préparation d’échantillon
- Décongeler le mélange maître et le dosage à température ambiante pendant au moins 20 min.
- Diluer les échantillons d’ADNc à une concentration de 300 ng dans 6 μL d’eau.
- Manipulez doucement le mélange maître et préparez le mélange dans un tube stérile avec 8,7 μL de mélange maître, 0,87 μL de l’amorce de test CDH1a conçue sur mesure et 1,83 μL d’eau sans nucléase pour un volume final de 11,4 μL.
note: Pour plus de détails sur l’amorce de test CDH1a personnalisée, voir le tableau des matériaux.
- Transférez 11,4 μL du mélange préparé dans l’échantillon d’ADNc dilué, mélangez doucement et centrifugez brièvement.
note: Les volumes comprennent un excédent de 20 % pour compenser la perte de volume due au pipetage. Préparez le mixage pour tous les échantillons et un contrôle sans modèle (NTC).
- Préparation des copeaux
Remarque : Pour des résultats optimaux, chargez les puces dès que possible.
- Branchez le chargeur de copeaux et attendez que le voyant devienne vert.
- Retirez le capuchon de la seringue de liquide d’immersion en tirant doucement le piston de 1 à 2 mm vers l’arrière et en le relâchant pour faciliter cette étape, et remplacez-le par un embout.
- Prenez une nouvelle puce et notez le code écrit sur le couvercle pour l’associer à l’échantillon.
- Tenez soigneusement le couvercle sur le côté, décollez le film protecteur et placez le couvercle avec la face collante vers le haut dans le bon sens.
- Prenez soigneusement un copeau, en prenant soin de ne pas toucher la partie interne, et chargez-le sur le nid de copeaux dans la bonne position en appuyant sur le levier pour ouvrir la pince.
- Chargez une nouvelle lame de chargement sur le chargeur et poussez-la doucement pour vous assurer qu’elle est fermement en place.
- Transférez 14,5 μL du mélange réactionnel dPCR sur la lame de chargement sans faire de bulles d’air ni dévier la lame, après quoi appuyez sur le bouton de chargement noir pour répartir le volume sur la puce.
- À l’aide de la seringue de liquide d’immersion, transférez environ 20 gouttes sur la surface de la puce en prenant soin de ne pas toucher la surface avec l’embout.
note: Il est important de couvrir toute la surface sans renverser de liquide sur les bords.
- Tournez le bras du chargeur pour que le couvercle entre en contact avec la puce et appuyez pendant 15 s.
- Appuyez sur le bouton du couvercle pour libérer la puce et remettre le bras en position.
- Tenez la puce assemblée à un angle de 45° et distribuez soigneusement le liquide d’immersion avec la seringue à travers l’orifice de remplissage, tournez légèrement la puce pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air et retirez tout excès de liquide avec une lingette stérile.
- Fermez le boîtier à puce en décollant doucement l’étiquette sur le dessus du couvercle de la puce et appuyez sur l’orifice de remplissage pendant au moins 5 s.
- Stockez la puce dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elle soit prête à être chargée dans le thermocycleur.
note: Les chips préparées doivent être utilisées dans les 2 h.
- Réaction dPCR
- Ouvrez le couvercle et installez les adaptateurs sur les deux blocs, même lorsqu’un seul bloc est utilisé.
- Placez les copeaux sur le bloc d’échantillon dans la bonne position.
note: L’orifice de remplissage doit être orienté vers l’avant du thermocycleur en position surélevée pour permettre aux bulles d’air de flotter vers le haut sans perturber la fenêtre de la puce. Utilisez des jetons vides pour équilibrer les deux blocs.
- Posez le tampon thermique sur le bloc d’échantillon pour couvrir complètement les copeaux.
- Fermez le couvercle et démarrez le cycle PCR en appliquant les conditions suivantes : maintenir à 96 °C pendant 10 min ; 45 cycles de 60 °C pendant 2 min et 98 °C pendant 30 s ; maintenir à 60 °C pendant 2 min ; maintenir à 4 °C. Éteignez le thermocycleur et décongelez les copeaux à température ambiante pendant au moins 10 min><.
note: L’analyse des copeaux doit être effectuée dans l’heure.
- Analyse des copeaux
- Ouvrez le couvercle de l’instrument et retirez les coussinets thermiques, puis retirez les puces des adaptateurs.
note: Conservez les copeaux dans un endroit sombre et propre jusqu’à l’analyse.
- Nettoyez la surface de la puce avec de l’isopropanol et une lingette stérile.
note: Inspectez chaque puce pour détecter les fuites ou les problèmes potentiels.
- Insérez l’USB dans le système de détection pour enregistrer les données.
- Ouvrez le plateau de puces du système de détection, chargez la puce face vers le haut dans la bonne position, puis fermez le plateau.
- Attendez 30 s pour le traitement, puis retirez la puce et insérez la suivante.
- Attendez la fin de l’analyse pour toutes les puces traitées puis insérez l’USB dans un ordinateur pour transférer les fichiers.
note: Le temps total d’analyse est d’environ 2 à 3 min/puce.
3. Analyse et interprétation des données
- Connectez-vous à la plate-forme logicielle basée sur le cloud nécessaire pour effectuer toutes les analyses en aval.
- Créez un projet et importez tous les fichiers de données des puces qui vous intéressent.
- Entrez le nom de l’échantillon, sélectionnez le colorant et le dosage utilisés dans l’onglet « Définir les puces ».
- Déterminez si la puce est acceptable en la visualisant dans l’onglet « Examiner les données », en vérifiant à quel point l’échantillon a été chargé sur la puce et combien de points de données sont évaluables.
note: Rejetez les puces avec moins de 13 000 points de données évaluables.
- Passez au nuage de points de la puce sélectionnée sur le côté droit de l’écran ; appliquez un seuil de 6 000 pour les signaux de colorant rapporteur de fluorescéine amidite (FAM) (axe Y) à toutes les puces.
note: La configuration du seuil peut varier en fonction des dosages utilisés.
- Supprimez tous les signaux positifs douteux pour éviter les résultats faussement positifs en sélectionnant l’endroit relatif sur le nuage de points à l’aide de l’outil lasso et en appuyant sur « indéterminé ». Tous les points positifs restants indiquent la présence de copies d’ADNc de la cible rare analysée.