Dosage par transfert de points pour quantifier le génome viral

REMARQUE : Les recettes pour les solutions et les tampons nécessaires à ce protocole sont fournies dans le Tableau 1.

1. Tache de point

1. Préparation d’étalons d’ADN plasmidique
   1. Diluer l’ADN plasmidique du génome du vecteur AAV à 10 ng/μL dans de l’eau ou un tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Prélever 25 μL de cette dilution et digérer avec une enzyme de restriction appropriée pendant 1 h pour linéariser l’ADN plasmidique dans un volume de réaction de 50 μL.
      note: Nous effectuons une digestion dupliquée (voir étape 1.4.1). L’enzyme appropriée doit être celle qui coupe l’ADN plasmidique en dehors de la région de liaison à la sonde dot blot. Pour plus de commodité, l’ADN plasmidique dilué peut être aliquote (25 μL/tube) et stocké congelé à -20 °C pour une utilisation future. Digérez l’ADN plasmidique pendant que les tubes tremblent à l’étape 5.1. Ne pas trop digérer l’ADN plasmidique standard.
   2. Ajouter 450 μL d’eau ou d’ÉT dans le tube contenant l’étalon d’ADN plasmidique digéré et bien mélanger. Transférez 70 μL de ce mélange dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec 1 330 μL d’eau ou d’ET pour obtenir un étalon plasmidique dilué (25 pg/μL).
   3. Suivez le tableau 1 pour créer un ensemble de dilutions en série doubles (600 μL/tube). Bien mélanger les dilutions en tourbillonnant pendant 5 s.
2. Dénaturation d’étalons et d’échantillons d’ADN viral
   1. Ajouter 600 μL de solution alcaline 2x à chaque dilution étalon. Bien mélanger en tourbillonnant pendant 5 à 10 s. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
   2. Ajouter 120 μL de solution alcaline 2x à chaque échantillon d’ADN viral. Bien mélanger en tourbillonnant pendant 5 à 10 s. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
3. Mise en place de l’appareil de transfert de points
   1. À l’aide de ciseaux, couper une membrane de transfert (p. ex., sonde zêta) à une taille appropriée pour le nombre d’échantillons et d’étalons. Imbibez la membrane d’eau pendant 10 minutes avant de la placer sur un appareil à tamponnage. Couvrir les puits inutilisés sur l’appareil à membrane.
      note: Manipulez la membrane avec une pince à épiler propre. Pour couvrir les puits vides, la feuille de protection bleu clair fournie avec la membrane peut être utilisée. Ne laissez pas la membrane sécher avant de lier les échantillons et les étalons. Pour plus de détails sur l’assemblage et l’utilisation de l’appareil, veuillez vous référer au manuel d’utilisation.
   2. Ajoutez de l’eau aux puits dans lesquels les échantillons seront chargés. Appliquez l’aspirateur et tirez l’eau à travers les puits pour vérifier les erreurs et refaites le test une fois corrigé. Serrez à nouveau les vis tout en appliquant le vide pour assurer une étanchéité parfaite.
      note: Une étanchéité incomplète peut provoquer des fuites d’échantillons entre les puits.
   3. Une fois que l’eau est complètement aspirée, relâchez complètement le vide (c’est-à-dire que le collecteur de vide doit être ouvert à la pression de l’air).
4. Chargement d’étalons et d’échantillons sur l’appareil de transfert de points
   1. Appliquez 400 μL de chaque étalon d’ADN plasmidique dilué dans chaque puits et effectuez quatre voies de dilutions standard. Utilisez deux aliquotes distinctes de la synthèse standard et chargez-les chacune en double. Appliquer 200 μL/puits de chaque échantillon d’ADN viral.
      note: En utilisant les ~40 μL restants d’échantillons dénaturés, des échantillons dilués peuvent être préparés (p. ex., des échantillons dilués 10 fois en utilisant 20 μL de l’échantillon plus 180 μL de 1 solution alcaline) et tamponnés si nécessaire.
   2. Appliquez un léger vide pour tirer les solutions d’ADN à travers le puits.
      note: La pression de vide doit être ajustée en ouvrant partiellement une vanne à trois voies de sorte que la pression de vide soit appliquée à l’appareil de transfert de points ainsi qu’à l’atmosphère (c’est-à-dire avec les bras du robinet positionnés à un angle d’environ 45° où il fait un bruit d’aspiration plus fort).
   3. Une fois tous les puits vidés, libérez le vide en ajustant la vanne à trois voies. Ajouter 400 μL de 1 solution alcaline dans chaque puits contenant des étalons et des échantillons. Attendez 5 min avant de réappliquer l’aspirateur pour vider les puits.
   4. Réappliquez l’aspirateur de la même manière.
   5. Démontez l’appareil à tampon sous vide, retirez la membrane et rincez-le avec 2x SSC. Placez la membrane sur une serviette en papier propre avec le côté lié à l’ADN vers le haut pour éliminer l’excès de SSC 2x.
   6. Réticulation UV de l’ADN blotté à la membrane à l’aide d’un réticulant UV approprié ; la membrane est maintenant prête pour l’hybridation.
      note: Les membranes humides peuvent être utilisées pour la réticulation UV. Les membranes séchées et réticulées aux UV peuvent être conservées à température ambiante. Vous trouverez de plus amples informations dans la table des matériaux.

2. Hybridation et lavage

1. Réchauffez le tampon d’hybridation dans un bain-marie à 65 °C.
2. Marquez enzymatiquement une sonde d'ADN avec du dCTP radioactif ^α-32P et purifiez-la à l'aide de kits disponibles dans le commerce conformément aux recommandations du fabricant.
   note: Nous utilisons une sonde de 0,5 à 2,0 kb de longueur provenant d’une région promoteur-amplificateur ou d’une séquence codant pour une protéine dans le génome viral. Bien que ce protocole utilise des sondes radioactives marquées ³²P pour la détection des signaux, des sondes chimiluminescentes ou fluorescentes non radioactives peuvent également être utilisées (veuillez vous référer à la section Discussion).
3. Placez la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté lié à l’ADN vers le haut, rincez la membrane avec 5 ml de tampon d’hybridation préchauffé et jetez le tampon. Ajoutez ensuite 10 ml de tampon d’hybridation préchauffé et placez la bouteille dans un four d’hybridation rotatif réglé à 65 °C. Tournez pendant ≥5 min.
4. Dénaturer à la chaleur 20 μL de solution d’ADN de hareng ou de spermatozoïde de saumon cisaillée à 10 mg/mL et la sonde ^{marquée 32}P (≥10⁷ cpm) pendant 5 min en plaçant les tubes sur un bloc chauffant réglé à 100 °C. Ensuite, réfrigérez-les sur de la glace pendant ≥2 min, essorez-les brièvement et conservez-les sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
   prudence: Pour les sondes d’ADN radioactif, des tubes de 1,5 mL avec des bouchons à vis et des joints toriques doivent être utilisés.
5. Ajoutez rapidement l’ADN du spermatozoïde dénaturé et la sonde radioactive au tampon d’hybridation dans la bouteille d’hybridation et secouez la bouteille pendant 10 secondes pour mélanger. Remettez la bouteille dans le four à 65 °C et incubez la bouteille en tournant à 65 °C pendant ≥4 h.
6. Une fois l’hybridation terminée, arrêtez la rotation, retirez le flacon d’hybridation, puis versez la solution de sonde radioactive dans un tube conique de 50 ml avec un bouchon étanche. Conservez la sonde dans un récipient approprié placé dans un réfrigérateur destiné aux matières radioactives.
   note: Le tampon d’hybridation usagé avec une sonde stockée à 4 °C peut être réutilisé au moins 5 fois en plaçant le tube conique de 50 ml avec un bouchon étanche contenant le tampon d’hybridation dans un bain-marie à 100 °C pendant 5 min.
7. Lavez la membrane avec un tampon de lavage chauffé à 65 °C. Ajoutez 20 à 30 ml de tampon de lavage dans la bouteille d’hybridation et tournez pendant 5 min. Répétez ce lavage 2 fois de plus.
   note: Mesurer la radioactivité des solutions de lavage et l’enregistrer si l’institut local l’exige.
8. Pendant le lavage de la membrane, placez un écran d’imagerie au phosphore sur une gomme d’image pendant 5 min.
9. Après le troisième lavage, retirez la membrane de la bouteille d’hybridation, retirez l’excès de tampon sur la membrane avec des serviettes en papier et placez la membrane dans un porte-papier en plastique transparent. Vérifiez les signaux radioactifs sur la membrane à l’aide d’un compteur Geiger. Exposez l’écran d’imagerie au phosphore effacé à la membrane pendant 10 minutes à toute la nuit, en fonction de l’intensité du signal.
10. Scannez l’écran à l’aide d’un système de balayage d’image au phosphore et obtenez les données sur l’intensité du signal de chaque point.

Tableau 1 : Étalons quantitatifs d’ADN plasmidique par transfert de points. Les volumes nécessaires de solution étalon d’ADN plasmidique de 25 pg/μL et d’eau ou d’ET pour préparer des étalons d’ADN plasmidique par dilutions en série doubles (600 μL/tube) sont indiqués. Les nombres dans la colonne d’étalon d’ADN plasmidique (0,039 à 5 ng) correspondent à la quantité d’ADN dans 200 μL de chaque solution d’étalon d’ADN plasmidique.