1. Préparation des échantillons
- Prendre 50 mg de tissu de souris dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 200 μL de tampon de lyse (50 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1 % Triton X-100, 10 % glycérol), complété par des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase (100 mM NaF, 0,1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyle, 5 μg/mL de pepstatine, 10 μg/mL de leupeptine, 5 μg/mL d’aprotinine).
- Homogénéiser le tissu à l’aide d’un homogénéisateur pendant 1 min sur de la glace.
- Centrifugeuse pendant 10 min à 8 000 x g à 4 °C.
- Prélever le surnageant dans de nouveaux tubes (1,5 mL) et prélever 1 μL pour le dosage de la concentration en protéines à l’aide d’un kit BCA.
REMARQUE : Tous les tampons de lyse couramment utilisés pour l’analyse par transfert Western et l’analyse par transfert Dot peuvent être utilisés pour l’analyse QDB.
2. Déterminer la spécificité de l’anticorps
- Préparez l’échantillon de lysats (20 μg) de la section 1.4, BSA sans IgG (20 μg) et de protéines standard (600 pg), pour l’analyse par transfert Western.
REMARQUE : La BSA exempte d’IgG est utilisée comme témoin négatif et la protéine standard est utilisée comme témoin positif. La spécificité de l’anticorps est démontrée par l’affichage d’une bande de la bonne taille à l’aide de l’analyse par transfert Western.
3. Définition de la plage linéaire de l’analyse QDB
- Dissoudre la protéine standard avec du jdH2O. Diluer la protéine à une concentration de 1 200 pg/μL.
- Diluer la protéine concentrée des échantillons préparés à la section 1,4 à 4 μg/μL.
- Dissoudre la BSA avec du ddH2O. Diluer la protéine à une concentration de 1 200 pg/μL et 4 μg/μL.
- Une série de dilutions d’échantillons standard de protéines et d’échantillons préparés a été préparée à l’aide des tableaux 1 et 2.
- Mélangez 10 μL de protéines étalons de dilution ou des échantillons préparés à la dilution et 10 μL de tampon de charge 2x (120 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 % de glycérol, 4 % de SDS, 0,2 % de bleu de bromphénol, 200 mM de DTT).
- Chauffer les mélanges à 85 °C pendant 5 min.
4. Processus d’analyse QDB
- Exemple d’application
- Soutenez la plaque QDB pour éviter que le bas de la plaque ne touche la surface de la table. Par exemple, utilisez une boîte d’embout de pipette vide comme support.
- Chargez jusqu’à 2 μL de l’échantillon au centre de la membrane au bas de l’unité individuelle de la plaque QDB.
- Séchage de la plaque
- Laissez la plaque QDB chargée pendant 1 h à température ambiante (RT) ou laissez la plaque chargée à 37 °C pendant 15 min dans un espace bien ventilé.
- Blocage de la plaque
- Trempez la plaque QDB dans le tampon de transfert (0,039 M de glycine, 0,048 M Tris, 0,37 % SDS, 20 % d’alcool méthylique) et agitez doucement la plaque pendant 10 s.
- Rincez doucement la plaque QDB avec du TBST (solution saline tamponnée Tris, 0,1 % Tween 20) trois fois, puis lavez la plaque pendant 5 min dans du TBST en secouant constamment.
- Bloquer la plaque QDB avec un tampon bloquant (5 % de lait écrémé dans du TBST (100 μL/puits) pendant 1 h en secouant constamment.
- Incubation primaire de l’anticorps
- Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de blocage à une concentration choisie (de 1:500 à 1:5 000) et ajouter 100 μL à chaque puits individuel d’une plaque ordinaire de 96 puits. Insérez la plaque QDB dans la plaque à 96 puits et incubez les plaques combinées pendant 2 h à RT ou toute la nuit à 4 °C en secouant constamment.
- Alternativement, placez la plaque QDB à l’intérieur d’une boîte et remplissez la boîte avec un tampon de blocage à 2 à 3 mm au-dessus de la partie membranaire de la plaque si le même anticorps est utilisé pour toute la plaque. Ajouter l’anticorps primaire à la concentration choisie et incuber la plaque pendant 2 h à RT ou toute la nuit à 4 °C en agitant constamment.
- Rincez doucement la plaque avec du TBST trois fois avant de la laver trois fois avec du TBST, chaque fois pendant 5 minutes en secouant constamment.
- Incubation secondaire d’anticorps
- Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration choisie (de 1:1 000 à 1:50 000), et aliquote 100 μL/puits dans une plaque de 96 puits ou dans une boîte comme décrit à la section 4.4.2, puis incuber la plaque QDB à l’intérieur de la plaque de 96 puits chargée ou de la boîte pendant 1 h à RT sous agitation constante.
- Rincez doucement la plaque QDB 3 fois avec du TBST, puis lavez la plaque 3 fois, 5 min chacune avec du TBST en secouant constamment.
- quantification
- Préparez le substrat de chimiluminescence améliorée (ECL) en suivant les instructions du fabricant.
- Aliquote du substrat ECL dans une plaque de 96 puits (100 μL/puits) et insérez la plaque QDB à l’intérieur de la plaque de 96 puits pendant 2 min sous agitation constante.
- Retirez la plaque QDB de la plaque à 96 puits et secouez brièvement pour éliminer l’excès de liquide. Placez la plaque sur une plaque de microtitration blanche.
- Allumez le lecteur de microplaques et sélectionnez « plaque avec couvercle » sur l’interface utilisateur avant de placer les plaques combinées (plaque QDB + adaptateur de plaque blanche) à l’intérieur du lecteur de microplaques pour quantification.
REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser la plaque de microtitration blanche et non transparente comme adaptateur pour éviter toute interférence de la plaque. Assurez-vous de choisir « plaque avec couvercle » pour éviter de coincer la machine lorsque des plaques combinées (plaque QDB + adaptateur de plaque à 96 puits) sont placées à l’intérieur du lecteur de microplaques.
Table 1. Schéma de dilution pour la courbe protéique standard.
| S1
(0 pg/μl) | S2 (33,3 pg/μl) | S3
(100 gg/μl) | S3
(300 gg/μl) | S5
(600 pg/μl) | S6
(1200pg/μl) |
| Protéines standard (1200pg/μl) | 0 | 1,39 | 4.17 | 12,5 | 25 | 50 |
BSA
(4 pg/μl) | 50 | 48,61 | 45,83 | 37,5 | 25 | 0 |
| total | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tableau 2. Schéma de dilution des échantillons préparés
| X1
(0μg/μl) | X2
(0,25 μg/μl) | X3
(0,5 g/μl) | X4
(1μg/μl) | X5
(2μg/μl) | X6
(4 μg/μl) |
| Échantillon (4μg/μl) | 0 | 3,125 | 6.25 | 12,5 | 25 | 50 |
| BSA sans IgG (4μg/μl) | 50 | 46.875 | 43,75 | 37,5 | 25 | 0 |
| total | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
