REMARQUE : Ce protocole a été optimisé à l’aide de kits et de réactifs standardisés et disponibles dans le commerce afin d’augmenter la reproductibilité (voir le tableau des matériaux).
1. Préparation des échantillons
- Extraction des protéines
- Transférez des échantillons de cellules ou de tissus congelés à partir de -80 °C sur de la glace sèche, décongelez-les sur de la glace et lavez-les au besoin avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x glacée. Évitez les cycles de congélation-décongélation inutiles, car cela affectera la qualité des protéines.
- Ajouter à chaque échantillon un tampon de dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) (25 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1 % de NP-40, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS) contenant 1 inhibiteur de protéase en utilisant la quantité optimale par poids de tissu.
note: Selon l’application, le type et la quantité de tampon d’homogénéisation peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire.
- Utilisez un homogénéisateur électrique portatif avec un pilon en polypropylène pour homogénéiser les échantillons de tissus. Entre chaque échantillon, lavez le pilon dans de l’eau doublement distillée et séchez-le avec un mouchoir propre. Changez le pilon entre différentes conditions expérimentales et tissus.
- Laissez les échantillons sur de la glace pendant 10 minutes après l’homogénéisation. Centrifuger les échantillons à >10 000 x g à 4 °C pendant 10 min.
- Transférez le surnageant dans un nouveau tube sur de la glace sans déranger la pastille. Le surnageant est l’échantillon de protéines. Stockez la protéine extraite à -80 °C ou procédez directement à la mesure de la concentration en protéines.
- Quantification et normalisation de la concentration en protéines
- Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (BCA). Préparez un mélange de dosage de BCA selon les instructions du fabricant dans une plaque optique à 96 puits en utilisant 200 μL de mélange de BCA par puits.
note: D’autres méthodes de quantification telles que les tests de Lowry et de Bradford peuvent également être utilisées pour déterminer la concentration en protéines, à condition que la concentration en protéines soit quantifiée de manière cohérente dans toutes les expériences.
- Préparer des étalons d’albumine sérique bovine (BSA) à des concentrations croissantes en trois exemplaires et ajouter 1 μL de chaque échantillon de protéine en double. Incuber la plaque à 96 puits dans un bloc de chaleur préchauffé à 60 °C pendant 10 minutes ou plus si la concentration en protéines est prévue.
- Après l’incubation, mesurer l’absorption à 560 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
- Exportez les mesures du lecteur de plaques et calculez la concentration en protéines en comparant les valeurs moyennes d’absorbance de chaque échantillon à une courbe standard obtenue à l’aide de l’étalon de protéines. La valeur R carré de la courbe standard doit être supérieure ou égale à 0,98 pour estimer avec précision la concentration en protéines de l’échantillon.
- Normalisez la quantité de protéines en préparant des dilutions d’échantillons de protéines dans un tampon d’échantillon et de l’eau ultrapure. Le volume total peut être ajusté en fonction du type de gel utilisé. Il est recommandé de charger 30 μg de protéines par voie comme quantité de départ. Ajouter un agent réducteur tel que le dithiothréitol (DTT ; concentration finale 5 mM) ou le bêta-mercaptoéthanol (concentration finale 200 mM) à chaque échantillon au besoin. Pipeter du bêta-mercaptoéthanol non dilué dans une hotte.
- Incuber les échantillons dans un bloc thermique à 70 °C pendant 10 min. Mettez les échantillons sur de la glace, utilisez un vortex et tournez brièvement pour les recueillir. Garder sur la glace jusqu’à ce que le gel soit chargé.
2. Électrophorèse sur gel d’échantillons de protéines
- Configuration de l’appareil et du gel
- Mettre en place un gel préfabriqué à gradient de bis-tris à 4-12 % (voir tableau des matériaux) dans le système de chambre d’électrophorèse sur gel. Rincez les gels à l’eau bi-distillée avant utilisation.
REMARQUE : Selon la taille, les interactions et l’abondance de la protéine d’intérêt, des gels avec un gradient, un agent tampon ou une taille et un nombre de puits différents peuvent être utilisés.
- Ajouter 500 mL de 1x tampon de coulée MES SDS dilué dans de l’eau doublement distillée par réservoir. Retirez soigneusement le peigne des gels après avoir ajouté le tampon de coulage sans déranger les puits dans le gel d’empilage.
- Charge protéique
- Chargez 3,5 μL d’un étalon protéique dans le puits. Selon la disposition de l’échantillon, le chargement d’une échelle protéique des deux côtés du gel peut aider à estimer plus précisément la taille des protéines. Utilisez des pointes de chargement de gel à pointe fine pour un chargement plus précis des échantillons.
- Lorsque vous utilisez un étalon interne pour la normalisation entre les membranes (voir l’étape 5 ci-dessous et la discussion), chargez une quantité égale aux autres échantillons dans les 3 premiers puits à côté de l’échelle protéique.
- Chargez 30 μg de chaque échantillon dans les puits restants. Ajoutez 1 tampon d’échantillon à tous les puits vides.
- électrophorèse
- Assemblez le réservoir de gel après avoir chargé les échantillons. Faites passer les échantillons à travers le gel d’empilement à 80 V pendant 10 min, puis à 150 V pendant 45 à 60 minutes supplémentaires.
3. Transfert de protéines
REMARQUE : Le transfert de protéines dans ce protocole est effectué à l’aide d’un système de buvard semi-sec disponible dans le commerce (voir la table des matériaux) pour des résultats rapides et cohérents.
- Préparez le transfert de protéines en prétrempant du papier filtre dans de l’eau doublement distillée et en vous assurant que le couteau à gel, la pipette Pasteur en plastique, le rouleau buvard et la pince sont prêts à l’emploi.
- Ouvrez la pile de transfert en retirant soigneusement toute la feuille d’emballage. Retirez le haut de la pile inférieure et mettez-le de côté. Humidifiez rapidement la membrane de la pile inférieure avec plusieurs gouttes de tampon d’électrophorèse (2-3 ml). Une fois la pile de transfert ouverte, il est important d’éviter que la membrane PVDF ne se dessèche.
- Après avoir arrêté l’électrophorèse, ouvrez le gel préfabriqué à l’aide du couteau à gel et coupez le gel d’empilement. Coupez le gel sur ses bords pour le libérer du moulage en plastique. Gardez le couteau à gel humide pour éviter d’endommager le gel.
- Assemblez la pile de transfert de bas en haut : pile inférieure (contenant la membrane PVDF), gel protéiné et papier filtre. Utilisez le rouleau buvard pour éliminer toutes les bulles d’air. Placez la pile supérieure sur le papier filtre et roulez à nouveau la pile pour éliminer les bulles d’air. Ne poussez pas trop fort car cela pourrait provoquer une déformation du gel lors du transfert de protéines.
- Transférez l’ensemble de la pile dans le dispositif de transfert avec l’électrode sur le côté gauche de l’appareil et placez l’éponge de gel sur le dessus de la pile de manière à ce qu’elle soit alignée avec les contacts électriques correspondants sur l’appareil. Fermez le couvercle, sélectionnez et démarrez le programme approprié (20 V pendant 7 min est un point de départ recommandé).
- Lorsque vous avez terminé, laissez le couvercle fermé pendant 2 minutes pour permettre à la pile de refroidir et pour éviter que la membrane ne se dessèche. Retirez la pile de transfert et coupez la membrane à la taille du gel. Lavez rapidement la membrane coupée avec de l’eau doublement distillée avant de poursuivre avec la coloration totale des protéines.
4. Coloration des protéines totales
REMARQUE : L’utilisation de la détection fluorescente offre un avantage substantiel par rapport aux approches plus traditionnelles (par exemple, la détection ECL), car la plage linéaire et la sensibilité peuvent être beaucoup mieux contrôlées. Par conséquent, dans les étapes 4 et 5, le TPS fluorescent et les anticorps secondaires fluorescents sont utilisés (voir le tableau des matériaux).
- Roulez la membrane dans un tube de 50 mL avec le côté protéique vers l’intérieur. En raison de la sensibilité à la lumière du TPS fluorescent et des anticorps secondaires, toutes les étapes suivantes sont effectuées dans l’obscurité.
- Ajouter 5 mL de solution de coloration protéique (voir le tableau des matériaux) et incuber sur un rouleau pendant 5 min à température ambiante. Étant donné que le TPS et le tampon de lavage contiennent du méthanol, effectuez ces étapes dans une hotte.
- Jetez la solution de coloration et lavez deux fois rapidement avec les 5 ml de solution de lavage (6,3 % d’acide acétique dans 30 % de méthanol). Replacez brièvement le tube sur le rouleau entre les étapes de lavage. Rincez brièvement la membrane à l’eau ultrapure avant de continuer.
5. Blocage, incubation d’anticorps et détection
- Blocage de la membrane : Ajouter 3 mL de tampon de blocage (voir le tableau des matériaux) dans le tube de 50 mL contenant la membrane. Incuber la membrane sur un rouleau pendant 30 min à température ambiante. En fonction du choix de l’anticorps, le type de tampon de blocage utilisé peut nécessiter une optimisation.
- Incubation primaire de l’anticorps
- Jetez le tampon de blocage et remplacez-le par l’anticorps primaire à la concentration appropriée et optimisée (Figure 1 et Figure 2 : anti-SMN de souris, à 1:1 000, dilué dans un tampon de blocage).
note: L’optimisation adéquate des anticorps primaires doit inclure la confirmation que l’anticorps détecte un produit protéique de la bonne taille tout en ne montrant aucune liaison ou une liaison minimale à d’autres produits protéiques non spécifiques. Si possible, testez et comparez plusieurs anticorps contre la protéine d’intérêt.
- Incuber la membrane sur un rouleau pendant une nuit à 4 °C. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez-la 6 fois pendant 5 min avec 1x PBS sur un rouleau à température ambiante (RT).
- Incubation secondaire d’anticorps
- Préparez l’anticorps secondaire spécifique à 1:5 000 contre l’hôte de l’anticorps primaire dans un tampon de blocage de 5 ml. D’autres anticorps secondaires peuvent nécessiter d’autres dilutions ou l’utilisation d’autres tampons bloquants.
- Incuber la membrane avec la solution d’anticorps secondaires sur un rouleau pendant 1 h à RT. Après l’incubation, laver la membrane trois fois 30 min avec 1x PBS sur un rouleau.
- Séchez la membrane et protégez-la de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium jusqu’à ce qu’elle soit détectée. Les membranes peuvent être conservées à 4 °C pour un stockage à long terme.
- Acquisition d’images
- Connectez-vous à l’ordinateur connecté au scanner. Placez la membrane sur le scanner avec le côté protéique vers le bas et sélectionnez la zone de balayage dans le logiciel.
- Optimisez l’intensité laser pour les deux canaux (700 nm et 800 nm), en confirmant qu’il n’y a pas de saturation. Acquérez les images dans les deux canaux et exportez-les pour une analyse plus approfondie (étape 6).
6. Analyse et quantification par transfert de Western
REMARQUE : Ces recommandations sont basées sur le logiciel Image Studio disponible gratuitement. Cependant, des analyses comparables peuvent également être effectuées à l’aide d’autres logiciels, tels qu’ImageJ.
- Importer le fichier : créez un espace de travail local sur l’ordinateur utilisé pour l’analyse. Cela génère une base de données de fichiers d’images pour les western blots acquis. Importez les fichiers obtenus sur le scanner et sélectionnez l’image à analyser.
- Analyse TPS
- Affichez le canal 700 nm pour afficher le résultat total de la coloration des protéines. La figure 1 présente un exemple d’image TPS, dans laquelle différents tissus de souris néonatales (P5) (figures 1A-B) et de souris âgées de 10 semaines (figure 1C-D) sont comparés directement. De même, la figure 2 montre un exemple de comparaison directe du tissu cérébral de souris d’âges différents.
- Sélectionnez l’onglet Analyse dans le coin supérieur droit et sélectionnez Ajouter un rectangle pour définir la zone d’intérêt pour la normalisation (Figure 1B, D). Copiez et collez la première zone rectangulaire sur chaque échantillon individuel pour vous assurer que la région définie est de la même taille pour toutes les voies analysées.
- Copiez le résultat à partir de l’onglet Formes dans le coin inférieur gauche du logiciel.
- Quantification
note: L’approche optimale pour quantifier les échantillons dépend de la conception expérimentale. Nous fournirons ici un exemple illustratif de la détection de la protéine de survie du motoneurone (Smn ; une protéine clé impliquée dans la maladie neuromusculaire de l’amyotrophie spinale), qui est connue pour diminuer avec le temps, et comment la normalisation de l’intensité du signal Smn en TPS fournit des estimations fiables du développement de l’expression des protéines.
- La figure 2 montre une diminution de l’expression de Smn avec l’âge de l’animal avec le TPS comme contrôle de la charge protéique. Répétez les étapes 6.2.1 à 6.2.3 pour quantifier la charge en protéines (figure 2B). Répétez les étapes 6.2.1 à 6.2.3 dans le canal de 800 nm (Figure 2A) pour analyser la protéine d’intérêt.
- Copiez les résultats du TPS et de la protéine d’intérêt dans un tableur. Sur la feuille de calcul, tout d’abord, normalisez la charge protéique en déterminant le signal TPS le plus élevé et en divisant chaque valeur de signal TPS par cette valeur pour obtenir la valeur de charge protéique normalisée.
- Divisez la valeur du signal de 800 nm de chaque échantillon individuel par sa valeur protéique normalisée correspondante pour calculer le rapport d’expression relatif des protéines dans différents échantillons.
- Après la première normalisation, comparez divers points temporels ou tissus à la valeur moyenne de l’étalon interne pour permettre des comparaisons directes entre différentes membranes et expériences.
