1. Détermination de la composition cellulaire dans la suspension cellulaire à l’aide de l’analyse par transfert Western sur cellule unique (scWB)
- Réhydratez la puce scWB avant de l’utiliser dans 15 ml de 1x tampon de suspension dans une boîte de Pétri pendant au moins 10 min à RT.
- Ajouter 1 mL de suspension unicellulaire diluée (10 000-100 000 cellules/mL) à la puce réhydratée. Placez la surface au fond d’une boîte de Pétri de 10 cm. Assurez-vous que la surface est à plat.
- Couvrez la boîte de Pétri avec un couvercle pour éviter le dessèchement et laissez les cellules se stabiliser pendant 5 à 15 minutes par un gradient.
- Placez la puce sous un microscope à fond clair et inspectez les puits à un grossissement de 10x.
note: Environ 15 à 20 % des micropuits devraient être occupés par une seule cellule, et moins de 2 % des puits devraient contenir 2 cellules ou plus.
- Inclinez la boîte de Pétri de 10 cm contenant la puce de 45 degrés.
- Lavez la puce avec le tampon de suspension 1x pour éliminer les cellules non capturées de la surface de la puce en pipetant doucement du haut vers le bas de la puce. Répétez l’opération 3 fois.
- Préparez l’instrument western à cellule unique.
- Réglez le temps de lyse, le temps d’électrophorèse et le temps de capture UV. Pour analyser les macrophages recrutés récupérés à partir du bouchon de gel dérivé de la membrane basale, utilisez les paramètres suivants : temps de lyse : 0 s ; temps d’électrophorèse : 160 s ; Temps de capture UV 240 s.
- Chargez soigneusement la puce dans la cellule d’électrophorèse de l’instrument Western à cellule unique, face au gel. Faites attention de ne pas endommager le côté gel de la puce.
- Versez le tampon de lyse/coulée dans la chambre et couvrez complètement l’ensemble de la puce Western à cellule unique. Démarrez la lyse cellulaire.
- Exécutez l’instrument scWB en utilisant les paramètres répertoriés dans la version 1.8.
- Une fois le passage terminé, transférez la puce dans une boîte de Pétri de 10 cm et lavez la puce deux fois avec 1x tampon de lavage pendant 10 min à RT.
- Préparer des dilutions de l’anticorps primaire (anti-vinculine : 1:10 ; anti-CD45 : 1:15, anti-CD11b : 1:20, anti-F4/80 : 1:10) dans un volume total de 80 μL de diluant d’anticorps (mélanger 8 μL d’anticorps 1 plus 8 μL d’anticorps 2 plus 64 μL de diluant).
- Ajoutez 80 μL de la solution d’anticorps primaire dans la chambre de sonde d’anticorps et abaissez la puce côté gel vers le bas de sorte que la solution d’anticorps traverse la puce.
- Incuber avec la solution d’anticorps primaires pendant 2 h à RT.
- Lavez la puce trois fois pendant 10 minutes dans 1x tampon de lavage sur le shaker.
- Lavez la chips une fois pendant 10 min dans l’eau du shaker pour dessaler le gel.
- Préparez une dilution de 1:20 de l’anticorps secondaire dans un volume total de 80 μL (mélangez 2 μL d’anticorps secondaires et 78 μL de diluant).
- Incuber la puce avec un anticorps secondaire pendant 1 h à RT à l’abri de la lumière.
- Lavez la puce trois fois pendant 10 minutes avec 1x tampon de lavage sur le shaker.
- Essorez la puce à l’aide d’une toupie coulissante pour retirer tout tampon de lavage restant.
- Balayez la puce sur un scanner à double réseau laser à une résolution de 5 μm au niveau du canal spectral du fluorophore couplé aux anticorps secondaires.
- Analysez les données à l’aide d’un logiciel spécifique à scWB.
2. Démontage de la puce scWB
- Conservez la puce numérisée dans un tampon de lavage jusqu’au moment de le décaper.
- Placez le bain-marie dans une hotte.
- Placez un support tubulaire de 50 ml dans le bain-marie avec l’eau à seulement 1 cm au-dessus du support et réglez la température de l’eau à 60 °C.
- Préparez le tampon de dénudage. Pour 1 L de solution tampon de décapage, dissoudre 9,85 g de Tris-HCl (pH 6,8) et 20 g de SDS dans 900 mL d’eau distillée et ajuster le pH. Remplissez ensuite d’eau distillée jusqu’à 1 L. Ajoutez 0,8 % (v/v) de β-mercaptoéthanol (β-ME ; 14,3 M) immédiatement avant chaque utilisation.
- Après le balayage initial, placez la puce dans une boîte de Pétri de 10 cm avant de décaper.
- Pour chaque puce, prélever 40 ml de tampon de décapage et ajouter 320 μl de β-ME.
ATTENTION : β-ME est toxique et dangereux pour l’homme et l’environnement. La procédure suivante doit être effectuée dans une hotte.
- Placez la puce dans la cartouche et scellez-la avec du parafilm pour empêcher l’eau de s’infiltrer dans la cartouche
- Placez la cartouche à l’intérieur du support de tube dans le bain-marie préchauffé.
- Incuber pendant 90 min.
- Retirez délicatement la puce de la cartouche et placez-la dans une boîte de Pétri fraîche.
- Lavez brièvement la puce une fois avec 1x tampon de lavage. Ajoutez ensuite 15 ml de 1 tampon de lavage dans la boîte de Pétri.
- Lavez la puce pendant 15 min sur un shaker. Répétez l’étape de lavage quatre fois.
note: La puce est prête pour le prochain anticorps primaire (voir les étapes 1.12 à 1.21)
