Dosage par transfert Western chimiluminescent pour le traitement des protéines

Résumé

Source : Hillert-Richter, L. K. et al., Mesure de la composition du complexe de signalisation induisant la mort CD95 et traitement de la procaspase-8 dans ce complexe. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo décrit le transfert western basé sur la chimiluminescence des lysats immunoprécipités. La technique aide à déterminer le traitement et l’activation des protéines. Le signal chimiluminescent détecté est proportionnel au niveau de traitement des protéines lors de son activation.

Protocole

Les expériences sur les cellules T ont été réalisées conformément à l’accord éthique 42502-2-1273 Uni MD.

1. Préparation des cellules pour l’expérience

REMARQUE : Le nombre moyen de cellules pour cette immunoprécipitation est de 1 × 10⁷. Les cellules adhérentes doivent être ensemencées un jour avant l’expérience de sorte qu’il y ait 1 × 10⁷ cellules le jour de l’expérience.

1. Préparation des cellules adhérentes pour l’expérience
   1. Semez 5 à 8 × 10 6 cellules adhérentes dans 20 mL de milieu (voir le tableau des matériaux pour la composition) pour chaque condition dans des boîtes de 14,5 cm un jour avant le début de l’expérience.
   2. Le jour de l’expérience, assurez-vous que les cellules sont confluentes à 80-90 % et adhèrent à la parabole. Jetez le milieu et ajoutez du milieu frais aux cellules adhérentes.
2. Préparation des cellules en suspension pour l’expérience
   1. Placez soigneusement 1 × 10⁷ cellules de suspension dans 10 mL de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des boîtes de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
   2. Si vous utilisez des cellules primaires, isolez les cellules T primaires conformément à la procédure décrite précédemment. Traiter les lymphocytes T primaires avec 1 μg/mL de phytohémagglutinine pendant 24 h, suivi d’un traitement à 25 U/mL d’IL2 pendant 6 jours.
   3. Placez soigneusement 1 × 10⁸ lymphocytes T primaires dans 10 ml de milieu de culture (voir le tableau des matériaux pour la composition) par condition dans des boîtes de 14,5 cm immédiatement avant le début de l’expérience.
      note: Ce nombre plus élevé de lymphocytes T primaires est recommandé, car ces cellules sont plus petites.

2. Stimulation du CD95L

1. Stimulez les cellules avec le CD95L (produit comme décrit précédemment ou disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
   note: La concentration du CD95L et le temps de stimulation dépendent du type cellulaire. Préparez deux fois une condition de stimulation pour générer un échantillon de « contrôle de billes » en parallèle.
   1. Stimulez les cellules adhérentes avec la concentration sélectionnée de CD95L. Tenez la plaque en biais et piquez le ligand dans le milieu sans toucher les cellules adhérentes.
   2. Stimulez les cellules en suspension avec le CD95L en pipetant la solution de ligand dans la suspension cellulaire.

3. Récolte cellulaire et lyse

1. Placez les paraboles cellulaires sur de la glace.
   note: Ne jetez pas le support. Les cellules mourantes flottent dans le milieu et sont importantes pour l’analyse.
2. Ajoutez 10 ml de solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) dans la suspension cellulaire et grattez les cellules attachées de la plaque. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml.
3. Lavez deux fois la parabole avec 10 ml de PBS froid et placez la solution de lavage dans le même tube de 50 ml. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 5 min, 4 °C.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de PBS froid.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 5 min, 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lyse (contenant 4 % de cocktail inhibiteur de protéase). Incuber 30 min sur de la glace.
7. Centrifuger le lysat à vitesse maximale (~17 000 × g) pendant 15 min, 4 °C.
8. Transférez le surnageant (lysat) dans un tube propre. Jetez la pastille. Prenez 50 μL de lysat dans un autre tube. Analyser la concentration en protéines par le test de Bradford et prélever la quantité de lysat correspondant à 25 μg de protéines dans un flacon. Ajoutez un tampon de chargement (voir la table des matériaux pour la composition) au flacon. Conservez-le à -20 °C comme contrôle du lysat.

4. Immunoprécipitation (IP)

1. Ajouter au lysat 2 μL d’anticorps anti-APO-1 et 10 μL de billes de sépharose de protéine A (préparées selon les recommandations du fabricant). Ajoutez seulement 10 μL des billes dans un tube séparé contenant du lysat (échantillon stimulé) pour générer un « contrôle des billes
   note: Utilisez des pointes de pipette à orifices larges, soit en coupant les pointes, soit en achetant des pointes spéciales pour IP lors de la manipulation des billes de sépharose de protéine A.
2. Incuber le mélange de billes de sépharose avec des anticorps/protéines A en les mélangeant doucement pendant une nuit à 4 °C. Centrifuger les lysats avec des billes de sépharose anticorps/protéine A à 500 × g pendant 4 min, 4 °C. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de PBS froid aux billes et répéter cette étape au moins trois fois.
3. Jetez le surnageant. Aspirez les perles de préférence avec une seringue Hamilton de 50 μL.

5. Transfert de Western

1. Ajouter 20 μL de tampon de chargement 4x (voir le tableau des matériaux pour la composition) dans les billes et chauffer à 95 °C pendant 10 min. Chauffer les témoins de lysat à 95 °C pendant 5 min.
2. Chargez les lysats, les IP et un étalon protéique sur un gel de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 12,5 % (voir le tableau des matériaux pour la préparation du gel) et faites-le fonctionner avec une tension constante de 80 V.
3. Transférez les protéines du gel SDS vers une membrane de nitrocellulose.
   note: Ici, la technique semi-sèche, optimisée pour les protéines d’intérêt, a été utilisée pour le transfert sur 12 min (25 V ; 2,5 A= constante). Faites tremper la membrane de nitrocellulose et deux piles de transfert de taille miniature dans un tampon d'électrophorèse (voir le tableau des matériaux pour la composition, préparer selon les instructions du fabricant) pendant quelques minutes avant le western blot.
4. Placez la membrane tamponnée dans une boîte et bloquez-la pendant 1 h dans une solution bloquante (0,1 % de Tween-20 dans du PBS (PBST) + 5 % de lait). Incuber la membrane avec la solution de blocage sous une légère agitation.
5. Lavez la membrane trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque lavage.

6. Détection par transfert Western

1. Ajouter le premier anticorps primaire à la dilution indiquée (voir tableau des matériaux) dans la membrane et l’incuber pendant la nuit à 4 °C en l’agitant doucement.
2. Lavez la membrane trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque lavage.
3. Incuber la membrane avec 20 mL d’anticorps secondaires (dilué 1:10 000 dans du PBST + 5 % de lait) en agitant doucement pendant 1 h à température ambiante.
4. Lavez la membrane trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque lavage.
5. Jeter le PBST et ajouter environ 1 mL de substrat de peroxydase de raifort à la membrane.
6. Détecter le signal chimiluminescent (voir Tableau des matériaux).
   note: Le temps d’exposition et le nombre d’images capturées dépendent de la quantité de protéines dans la cellule et de la spécificité des anticorps utilisés. Il doit être établi empiriquement pour chaque anticorps utilisé pour la détection.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12,5 % de gel SDS	Fait maison		Pour deux gels de séparation : 3,28 mL H2O distillé 2,5 mL Tris ; pH 8,8 ; 1,5 M 4,06 mL acrylamide 100 μL 10 % SDS 100 μL 10 % APS 7,5 μL TEMED Pour deux gels collecteurs : 3,1 mL H2O distillé 1,25 mL Tris ; pH 6,8 ; 1,5 M 0,5 mL acrylamide 50 μL 10 % SDS 25 μL 10 % APS 7,5 μL TEMED
Boîtes paraboliques de 14,5 cm	Greiner	Référence 639160
acrylamide	Carl Roth	Réf. A124.1
Pointes de pipette de filtre à aérosol avec filtre à haute récupération et orifice large	VWR	46620-664 (Amérique du Nord) ou 732-0559 (Europe)	Utilisé pour le pipetage des billes vers le lysat
Utilisé pour le pipetage des billes vers le lysat	Sigma Aldrich	A2103	Dilution : 1:4000 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	Fourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZO	Référence ALX-805-038-C100	Utilisé uniquement pour l’immunoprécipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	Référence MBL-M059-3	Dilution : 1:1000 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	Signalisation cellulaire	9662 L	Dilution : 1:2000 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	Fourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution : 1:20 dans PBST + 1:100 NaN3
anticorps anti-CD95	Santa Cruz	SC-715	Dilution : 1:2000 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	Fourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZO	Référence ALX-804-961-0100	Dilution : 1:10 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	Fourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution : 1:10 dans PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	Signalisation cellulaire	Référence 9542	Dilution : 1:1000 dans PBST + 1:100 NaN3
Aps	Carl Roth	Référence 9592.3
β-mercaptoéthanol	Carl Roth	4227,2
Solution Bradford Concentré de réactif de colorant pour dosage protéique 450ml	Bio Rad	Référence 500-0006	Utilisé selon les instructions du fabricant
CD95L	Fourni dans ces expériences par le Prof. P. Krammer ou peut être acheté par ENZO	Référence ALX-522-020-C005
Détecteur de chimiluminescence Chem Doc XRS+	Bio Rad
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase (PIC)	Sigma Aldrich	Référence ALX-522-020-C005	Préparé selon les instructions du fabricant
DPBS (10x) sans Ca, Mg	PAN Biotech	Réf. P04-53500	Dilution 1:10 avec H2O, conservation au réfrigérateur
Tampon d’électrophorèse	Fait maison		10x tampon d’électrophorèse : 60,6 g de Tris 288 g de glycine 20 g SDS et 2 L H2O dilution 1:10 avant utilisation
glycine	Carl Roth	Référence 3908.3
Chèvre Anti-souris IgG1 HRP	SouthernBiotech	Référence 1070-05	Dilution 1:10.000 dans le lait PBST + 5 %
Chèvre Anti-souris IgG2b HRP	SouthernBiotech	Référence 1090-05	Dilution 1:10.000 dans le lait PBST + 5 %
Chèvre Anti-Lapin IgG-HRP	SouthernBiotech	Référence 4030-05	Dilution 1:10.000 dans le lait PBST + 5 %
Interleukine-2 humaine (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	Pour l’activation des lymphocytes T
Kcl	Carl Roth	Référence 6781.2
KH2PO4	Carl Roth	Référence 3904.1
Tampon de chargement 4x Tampon d’échantillon Laemmli, 10 mL	Bio Rad	Référence 161-0747	Préparé selon les instructions du fabricant
Substrat Luminata Forte Western HRP	Millipore	WBLUFO500
Tampon de lyse	Fait maison		13,3 mL de Tris-HCl ; pH de 7,4 ; 1,5 M 27,5 mL de NaCl ; 5 M 10 mL d’EDTA ; 2 mM 100 mL de Triton X-100 ajouter 960 mL de H2O
Milieu pour cellules adhérentes DMEM F12 (1:1) avec glutamine stable, 2 438 g/L	PAN Biotech	Réf. P04-41154	Ajout de 10 % de FCS, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,0001 % de puromycine au milieu
Milieu pour lymphocytes T primaires	gibco par Life Technologie	21875034	Ajout de 10 % de FCS et de 1 % de pénicilline-streptomycine au milieu
lait en poudre	Carl Roth	Réf. T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	Réf. P030.3
NaCl	Carl Roth	Référence 3957,2
PBST	Fait maison		20x PBST : 230 g NaCl 8 g KCl 56,8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 sur 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 avant utilisation
PBST + lait 5 %	Fait maison		50 g de lait en poudre + 1 L de PBST
Pha	Thermo Fisher Scientific	R30852801	Pour l’activation des lymphocytes T
Puissance Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard Tout Bleu	Bio Rad	Référence 161-0373	Utilisation entre 3 et 5 μL
Protéines A Sepharose CL-4B billes	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Perles de résine Affinity préparées selon les instructions du fabricant
grattoir	VWR	Référence 734-2602
Sds	Carl Roth	4360.2
secoueur	Heidolph
Azoture de sodium	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367,3
Piles de transfert Trans Blot Turbo de taille mini	Bio Rad	170-4270	Utilisé selon les instructions du fabricant
Tampon de transfert TransBlot Turbo 5x	Bio Rad	10026938	Préparé selon les instructions du fabricant
TransBlot Turbo Membrane en nictrocellulose de taille mini	Bio Rad	170-4270	Utilisé selon les instructions du fabricant
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8 08 51 000
Triton X-100	Carl Roth	Référence 3051.4
Préadolescent-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000