Transfert de Southern pour détecter la recombinaison homologue dans le génome de cellules souches embryonnaires de souris

Résumé

Source : Li, J., et al. Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide du transfert de Southern et de la réaction en chaîne par polymérase. J. Vis. Exp. (2018).

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de transfert de Southern pour identifier les événements de recombinaison homologue dans le génome de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de sondes radiomarquées. Les régions de l’ADN contenant des événements de recombinaison homologue apparaissent sous forme de bandes distinctes lorsque la membrane contenant l’ADN lié à la sonde est exposée aux rayons X.

Protocole

1. Préparation de l’ADN génomique et digestion avec enzyme(s) de restriction)

1. Préparez des ADNg à partir de cellules souches embryonnaires (cellules ES) à l’aide d’un kit commercial (kit de purification d’ADN génomique) avec des modifications mineures.
   1. Retirer le milieu de la culture cellulaire ES et ajouter 500 μL de solution de lyse des noyaux, y compris la RNaseA, directement dans les puits pour lyser les cellules.
      note: Le lysat cellulaire peut être stocké à -80 °C ou traité immédiatement.
   2. Faites pipeter de haut en bas plusieurs fois pour lyser complètement les cellules et les transférer dans un tube propre de 1,5 ml.
   3. Ajouter un tiers du volume de la solution de précipitation des protéines dans le tube de 1,5 mL, agiter vigoureusement pendant 20 s, refroidir les échantillons sur de la glace pendant 5 min, puis centrifuger à une force de 2 000 x g pendant 5 min. Transvaser le surnageant dans un autre tube propre de 1,5 mL contenant un volume égal d’isopropanol ; mélanger doucement la solution. (Notez que des brins blancs ressemblant à des fils peuvent être vus à ce moment-là.) Centrifugeuse à une force de 2 000 x g pendant 1 min ; Ensuite, jetez le surnageant.
   4. Lavez la pastille d’ADNg avec 1 ml d’éthanol à 70 % à température ambiante, centrifugez-la à une force de 2 000 x g pendant 1 min, aspirez soigneusement le surnageant, puis séchez la pastille d’ADNg à l’air libre pendant 3 min.
   5. Dissoudre les ADNg avec 100 μL de solution de réhydratation de l’ADN, puis incuber à 65 °C pendant 1 h ou à 4 °C pendant la nuit.
   6. Stockez les ADNg à une température de 2 à 8 °C.
2. Digérez les ADNg avec RE Dra I. Mettez en place une réaction de digestion de 30 μL en mélangeant 3 μL de tampon 10x pour Dra I, 3 μL de Dra I, 10 μg d’ADNg/échantillon et H₂O jusqu’à 30 μL, et incubez à 37 °C pendant la nuit.
3. Vérifiez l’exhaustivité de la digestion par gel d’ADN, en analysant 5 μL de la réaction digérée, puis ajoutez les 3 μL de tampon de charge d’ADN 10x pour l’étape suivante.

2. Transfert de Southern

1. Criblage par transfert Southern
   1. Séparez les ADNg digérés par électrophorèse et transférez-les sur une membrane.
      1. Préparez un gel d’électrophorèse d’agarose à 1 % avec du bromure d’éthidium (EB), chargez les échantillons d’ADNg digérés et une échelle de 1 kb, et faites fonctionner le gel à basse tension (30 à 40 V) pendant la nuit.
      2. Sortez le gel et prenez une photo avec un système d’imagerie sur gel d’ADN après électrophorèse. Vérifiez si les ADNg digérés et séparés affichent une image semblable à celle d’un frottis.
      3. Faites tremper le gel dans un plateau avec une solution de HCl 0,2 N et agitez-le doucement pendant 20 min à température ambiante.
      4. Transférez le gel dans une solution dénaturante de l’ADN et agitez-le doucement pendant 20 min à température ambiante.
      5. Transformez le gel en une solution neutralisante d’ADN et agitez-le doucement pendant 20 min à température ambiante.
         note: Le gel a tendance à se casser après cette étape, il doit donc être manipulé avec soin.
      6. Utilisez le système de transfert rapide vers le bas pour transférer les ADN du gel à la membrane. Assemblez le TurboBlotter et la pile de transfert conformément aux instructions fournies par le fabricant.
         REMARQUE : Une solution saline de citrate de sodium (SSC) 10x ou 20x est utilisée comme tampon de transfert. En général, 3 h de transfert suffisent pour transférer 95 % des ADNg du gel à la membrane ; Cependant, un délai de transfert plus long est inoffensif.
      7. Retirez la membrane et lavez-la avec 2x SSC pendant 1 min, absorbez le liquide avec des mouchoirs, puis réticulez l’ADN avec la membrane à l’aide d’un réticulant UV.
         note: La membrane peut être conservée à 4 °C pendant une semaine.
2. Étiquetez les sondes d’ADN avec de la radioactivité.
   1. Purifier les plasmides de la sonde à l’aide d’un kit miniprep selon le protocole fourni par le fabricant.
   2. Libérer les fragments d’ADN des sondes du vecteur plasmidique par digestion EcoR I dans une solution réactionnelle comprenant 5 μL de tampon pour EcoR I, 2 μL d’enzyme EcoR I, 20 μg d’ADN plasmidique et H₂O jusqu’à 50 μL, pendant 2 h.
   3. Faites fonctionner un gel d’ADN à 1 % pour séparer les fragments d’ADN de la sonde du vecteur et purifiez les fragments d’ADN des sondes avec un kit d’extraction de gel d’ADN selon le protocole fourni par le fabricant.
   4. À l’aide de 1 μL de solution d’ADN, mesurez la concentration d’ADN des fragments d’ADN de la sonde à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 260/280 nm.
   5. Préparez 40 ng d’ADN de sonde dans un tube de 1,5 mL avec 45 μL de tampon TE, faites bouillir pendant 3 min, tournez brièvement, puis placez le(s) tube(s) sur de la glace pendant 2 min.
   6. Ajouter l’ADN de la sonde dénaturé par la chaleur dans le tube contenant les billes de marquage d’ADN prêtes à l’emploi (-dCTP), piquer de haut en bas pour mélanger, ajouter 5 μL de [α³²P]dCTP, puis incuber à 37 °C pendant 15 min.
   7. Purifiez les sondes marquées à l’aide de microcolonnes G-50 conformément aux instructions fournies par le fabricant, puis mesurez la radioactivité à l’aide d’un compteur à scintillation (en option).
3. Hybrider la ou les membranes avec les sondes marquées.
   1. Préhybrider la membrane.
      1. Préchauffer la solution d’hybridation à 42 °C pendant 30 min. Mélanger 20 mL de solution d’hybridation préchauffée avec 200 μg d’ADN de spermatozoïde de saumon bouilli dans un tube de 50 mL.
      2. Placez la membrane dans le tube d’hybridation. Ajouter la solution de préhybridation mixte dans le tube d’hybridation. Placez-le dans le four d’hybridation (réglez le roulement et la température à 42 °C) et laissez la préhybridation se poursuivre pendant 30 min.
   2. Hybrider la membrane avec la ou les sondes marquées.
      1. Sortir le tube d’hybridation et verser la solution de préhybridation dans un tube de 50 mL ; ajouter la sonde dénaturée (chauffée à 100 °C pendant 3 min) de l’étape 2.1.2.7 dans ce tube et mélanger délicatement.
         note: Réduisez les bulles induisantes.
      2. Remettre la solution mélangée dans le tube d’hybridation et effectuer l’hybridation à 42 °C pendant la nuit.
4. Laver la ou les membranes pour retirer les sondes non hybridées.
   1. Placez la ou les membranes dans un plateau avec 1x SSC + 0,1 % SDS et agitez doucement à 55-60 °C pendant 10 min.
   2. Transférez la ou les membranes dans un plateau avec 0,5x SSC + 0,1 % SDS et agitez doucement à 55–60 °C pendant 10 min.
   3. Vérifiez la radioactivité sur la ou les membranes à l’aide d’un compteur Geiger portable pour décider si un troisième lavage est nécessaire.
5. Exposer la radioactivité sur la membrane à des films radiographiques.
   1. Retirez le liquide de la ou des membranes lavées.
   2. Enveloppez la ou les membranes d’une pellicule plastique et fixez-les dans la cassette d’exposition.
   3. Exposez la membrane à deux feuilles de film radiographique dans une pièce sombre.
   4. Placez la cassette d’exposition à -80 °C pendant la nuit ou plus.
6. Développer les films pour visualiser les résultats. Évaluez si un clone ES correspondant est celui souhaité avec la recombinaison ciblée ou non, en fonction de la taille des bandes d’ADN détectées par les sondes.
7. Réhybridez la même membrane avec une autre sonde après avoir décapé la sonde usagée selon la procédure suivante : retirez la membrane usagée, lavez-la 1x avec du H₂O propre, puis incubez-la dans une solution de striping (55 % de formamide, 2 % de SSPE, 1 % de SDS, H₂O) à 65 °C en secouant doucement pendant 1 à 2 h.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d’extraction de gel QIAquick	QIAGEN	Référence 28704
Solution de dénaturation de l’ADN	VWR	Référence 351-013-131
Solution neutralisante d’ADN	VWR	Référence 351-014-131
EcoR I	Thermo Scientific	ER0271
Dra I	Thermo Scientific	ER0221
Micro-colonnes ProbeQuan G-50	GE Soins de santé	Référence : 28-9034-08
Solution d’hybridation Hybrisol I	Millipore	S4040
Perles d’étiquetage d’ADN prêtes à l’emploi (-dCTP)	VWR	Tél. : 27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Thermo Fisher	15557036
Solution d’ADN de spermatozoïdes de saumon	Thermo Fisher	15632011
Système de transfert Whatman TurboBlotter, grands kits	Fisher Scientific	Tél. : 09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer	NEG013H100UC
Film radiographique Kodak	Z&Z Médical	Référence 844 5702
QIAprep Kit Miniprep Spin	QIAGEN	Référence 27104
Solution de lyse des noyaux	Promega	A7941
Solution de précipitation de protéines	Promega	A7951