Northern Blot pour détecter et quantifier des microARN spécifiques dans l’extrait d’ARN total de tissus végétaux

Résumé

Source : Tirumalai, V., et al. pour la détection et la quantification des microARN végétaux. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons le Northern blot, une technique d’hybridation permettant de détecter et de quantifier les microARN (miARN) à partir de l’ARN total extrait des tissus végétaux.

Protocole

1. Électrophorèse sur gel

1. Arrêtez le pré-cycle et lavez les puits avant le chargement de l’échantillon.
2. Chauffer les échantillons à 98 °C pendant 1 min et charger les échantillons chauds dans le puits à l’aide d’embouts capillaires. Insérez la pointe dans le fond du puits de manière à ce que l’échantillon occupe une fine couche dans le puits.
3. Chargement complet de tous les échantillons. Inclure le chargement du marqueur de décennie de l’ARN.
4. Faites couler le gel à 80 V jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol coule presque complètement. Le bleu de bromophénol coule à 10 pb dans un gel d’acrylamide dénaturant à 15 %.

2. Préparation à l’électro-transfert

1. Coupez la membrane N+nylon aux dimensions d’une plaque de verre et étiquetez la membrane dans son coin supérieur droit avec un crayon HB.
2. Placez délicatement la membrane à la surface de l’eau stérile, face au côté étiqueté vers la surface de l’eau. Pré-tremper la membrane pendant 15 min.
3. Coupez 4 morceaux de papier buvard I aux dimensions d’un tampon en fibre.
4. Préparez le sandwich au gel en plaçant le côté gris de la cassette dans un plateau propre.
5. Pré-mouillez le tampon en fibre et placez-le sur la cassette. Éliminez les bulles d’air.
6. Pré-mouillez un morceau de papier buvard dans 1x TBE et placez-le sur le tampon en fibre. Éliminez les bulles d’air en faisant rouler une pipette en plastique sur le papier. Posez un autre morceau de papier buvard pré-humide et retirez les bulles d’air.
7. Retirez délicatement le gel de la cassette en cours d’exécution et placez-le sur la configuration sandwich, de sorte que le premier échantillon d’ARN chargé soit vers la droite.
8. Trempez doucement la membrane pré-trempée dans 1x TBE et placez-la sur le gel, face à l’étiquette vers le bas. Étalez pour éliminer les bulles d’air.
9. Trempez un morceau de papier buvard, posez-le sur la membrane et retirez les bulles d’air. Trempez un autre morceau de papier buvard, placez-le sur la configuration du sandwich et retirez les bulles d’air.
10. Complétez le sandwich en plaçant un tampon en fibre pré-humide sur la configuration et en fermant fermement la cassette.
11. Placez la cassette transblot dans le module et remplissez 1x TBE, pH 8,2, jusqu’au repère buvard.
12. Transfert à 10 V, une nuit à 4 °C.
13. Après le transfert, placez la membrane humide sur une feuille de papier et réticulez immédiatement l’ARN à la membrane par irradiation avec une lumière UV de 254 nm (120 000 μjoules/cm²). Le transfert réticulé peut être stocké à 4 °C pour une hybridation ultérieure.

3. Préparation de la sonde radiomarquée

1. Concevoir une sonde complètement complémentaire au petit ARN à détecter.
2. Étiquetez la sonde à l'aide du ƳP32ATP (obtenu à partir de BRIT) à son extrémité 5' en combinant les composants selon la recette fournie dans le tableau 1.
3. Incuber le mélange réactionnel ci-dessus à 37 °C pendant 30 min.
4. Séparez le ƳP32ATP non étiqueté de la sonde à l'aide d'une colonne Sephadex G-25 conformément au protocole du fabricant.

4.Hybridation du blot

1. Placez le transfert réticulé, côté ARN vers le haut, à l’intérieur d’une bouteille d’hybridation.
2. Mélangez vigoureusement le tampon d’hybridation ultra-sensible, ajoutez-en 10 mL et incubez le blot à l’intérieur d’un four d’hybridation maintenu à 35 °C, avec rotation.
3. Effectuer une pré-hybridation pendant 20 min.
4. Sortez la bouteille du four et ajoutez délicatement la sonde étiquetée dans le tampon d’hybridation.
5. Hybrider le blot à 35 °C, avec rotation pendant 12 h.
6. Après l’hybridation, transférez soigneusement la solution d’hybridation dans un tube de 15 ml. Cette solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à sa réutilisation.
7. Effectuez un lavage rapide du transfert pendant 2 minutes pour éliminer l’excès de solution d’hybridation en ajoutant 2 tampons SSC plus 0,5 % de SDS. Jetez la solution.
8. Incuber le transfert avec 2 tampons SSC plus 0,5 % SDS pendant 35 °C, avec rotation pendant 30 min.
9. Lavez à nouveau le tampon avec 0,5 tampon SSC plus 0,5 % SDS pendant 35 °C, avec rotation pendant 30 min.
10. Placez le tampon à l’intérieur d’un couvercle d’hybridation, retirez l’excédent de tampon et scellez-le.
11. Exposez-le à un écran d’imageur au phosphore sans rayonnement pendant la nuit à l’intérieur d’une cassette.
12. Détectez le signal d’hybridation à l’aide d’un imageur biomoléculaire et analysez les résultats à l’aide d’un logiciel approprié.

Table 1 : Table des recettes

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Tampon et solution	recette	Commentaires
10 X TBE	Tampon Tris 0,89 M	Le pH doit être réglé à 8,2 à l’aide d’acide acétique
	0,89 M Acide borique
	30 millions d’EDTA
Mélange de gel	15 % d’acrylamide-bisacrylamide sol, 19:1	Le mélange de gel ne doit pas contenir de cristaux d’urée
	8M d’urée
	1X TBE
Colorant de chargement de gel	0,05 % (p/v) de bleu de bromophénol	Des précautions doivent être prises lors de la manipulation du formamide désionisé
	0,05 % (p/v) Xylène xyanol
	100 % désionisé - formamide
Étiquetage de la sonde	Tampon PNK (10X, 2 μL)	Ce mélange contient des molécules radioactives, cette étape doit être effectuée par du personnel formé à l’intérieur d’un laboratoire radioactif
	Enzyme PNK (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Tampon de lavage - I	2X SSC
	0,5 % (p/v) SDS
Tampon de lavage - II	0,5 fois le SSC
	0,5 % (p/v) SDS
Tampon de décapage - I	0,5 fois le SSC
	0,1 % (p/v) de SDS
Tampon de décapage - II	0,1X SSC
	0,1 % (p/v) de SDS

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d’acrylamide-bisacrylamide à 40 %	sigma	A9926	chimique
Persulfate d’ammonium (APS)	BioRad	Référence 1610700	chimique
papier buvard	Papier buvard Whatman I	1001 à 125	Test
Bleu de bromophénol	sigma	B5525-5G	chimique
Embouts de charge capillaire	BioRad	2239915	Articles en plastique
Formamide désionisé	Ambion	AM9342	chimique
Bloc chauffant	Eppendorf	Référence 5350	appareil
Membrane Hybond N+nylon	Ge	RPN203B	Test
Bouteille d’hybridation	sigma	Z374792-1EA	Articles en plastique
Four d’hybridation	Thermo Scientific	Référence 1211V79	appareil
N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	sigma	T7024-25ml	chimique
Imageur au phosphore	GE- Scanner Typhoon	29187194	appareil
Écran et cassette PhosphorImager	GE Soins de santé	GE28-9564-75	appareil
Pipettes	Gilson, modèles : P20 et P10	FA10002M, FA10003M	Articles en plastique
Pipette en plastique	Faucon	Référence 357550	Articles en plastique
Appareil de gel de polyacrylamide	BioRad	1658003EDU	appareil
Colonne Sephadex G-25	GE Soins de santé	27532501	appareil
Concentrateur Speed Vac	Thermo Scientific	Tél. : 20-548-130	appareil
Spinwin	Tarsons	N° 1010	appareil
Polynucléotide kinase T4 (PNK)	Oné	M0201S	Test
Appareil de transblot	BioRad	1703946	appareil
Tampon d’hybridation ULTRAHyb	Ambion	AM8670	Test
urée	Fischer Scientific	Référence 15985	chimique
Réticulant UV	UVP	CL-1000L	appareil
tourbillon	Tarsons	N° 3020	appareil
Bain-marie	NÉOLAB	D-8810	appareil
Xylène cyanol	sigma	X4126-10G	Test