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REMARQUE : Les protéines recombinantes utilisées dans cette étude, Hsp90 et Cdc37, ont été obtenues commercialement (voir le tableau des matériaux).
1. Activation de la puce
NOTE : Tous les matériaux à utiliser dans l’expérience sont répertoriés dans la Table des matériaux. Filtrer toutes les solutions préparées à travers un filtre stérile de 0,2 μm.
- Préparez une solution de 1-éthyl-3-(3-diméthylamino propyl) carbodiimide (EDC) en ajoutant 2 mg d’EDC à 2,5 mL de tampon d’acide 1 M-2-(N-morpholino) éthane sulfonique (pH = 6,0) dans un tube de 15 mL. Préparez des solutions de N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) en ajoutant 6 mg de sulfo-NHS à 2,5 mL de tampon 1 M MES (pH = 6,0) dans un tube séparé de 15 mL. Aliquote 50 μL de chaque solution dans des tubes indépendants et conservez-les à -20 °C pour une utilisation future.
- Mélanger des volumes égaux de solution d’EDC et de sulfo-NHS (50 μL d’EDC + 50 μL de sulfo-NHS) en pipetant vers le haut et vers le bas (ne pas vortex).
REMARQUE : La solution mixte EDC/sulfo-NHS doit être utilisée dans les 30 minutes pour maintenir une réticulation efficace pour une fonctionnalisation correcte de la puce.
- Placez la puce du biocapteur (5,7 cm x 2,4 cm ; voir tableau des matériaux) fournie par l’entreprise dans une boîte de Pétri en verre avec un couvercle adapté. Il est suggéré d’effectuer toutes les étapes de fonctionnalisation impliquées dans l’activation de la puce dans la boîte de Pétri. Appliquez 50 μL de tampon MES de 1 M (pH = 6,0) sur la puce du biocapteur, incubez pendant 1 min à température ambiante, puis aspirez le tampon.
- Appliquez immédiatement 50 μL de solution EDC/sulfo-NHS sur la puce du capteur. Couvrir la boîte de Pétri et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Aspirer la solution EDC/sulfo-NHS de la puce.
- Rincer une fois la puce avec 50 μL de tampon MES 1 M (pH = 6,0) et aspirer le tampon MES.
2. Immobilisation des protéines cibles
- Rincez la puce 2 fois avec 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspirez le PBS de la puce et ajoutez la molécule cible, Hsp90 (50 μL ; 500 nM).
REMARQUE : Une incompatibilité de tampon peut ruiner l’ensemble de l’expérience ; par conséquent, avant l’expérience, il est important de s’assurer que la molécule cible se trouve dans le même tampon que celui utilisé pour l’étalonnage (par exemple, 1x PBS (pH = 7,4)). Si nécessaire, effectuez un échange de tampon par dialyse pendant la nuit avant l’expérience. Dans cette expérience, une dialyse d’une nuit a été réalisée pour les deux protéines recombinantes, Hsp90 et Cdc37, contre 1x PBS (pH = 7,4 ; voir le tableau des matériaux) avec un échange de tampon approprié à 4 °C. La concentration du matériel cible (Hsp90 dans ce cas) peut varier en fonction de différents protocoles expérimentaux et de la nature des matériaux cibles (protéines/peptides/ligands).
- Couvrez la boîte de Pétri en verre et laissez incuber pendant 30 min à température ambiante. Aspirer la solution contenant la molécule cible et rincer 3 fois avec 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspirez la solution 1x PBS (pH = 7,4) de la puce.
- Ajouter 50 μL de Quench 1 (3,9 mM d’alcool amino-PEG5 dans 1x solution PBS (pH = 7,4)) à la puce. Couvrir la boîte de Pétri en verre et incuber pendant 15 min à température ambiante. Aspirez la solution Quench 1 de la puce.
- Ajouter 50 μL de solution de trempe 2 (1 M d’éthanolamine (pH = 8,5)) à la puce. Couvrez la boîte de Pétri en verre et laissez incuber pendant 15 min à température ambiante. Aspirez la solution Quench 2 de la puce et rincez la puce 5 fois avec 50 μL de 1 PBS, en laissant la dernière gouttelette de PBS sur le capteur.
3. Préparation des échantillons d’analytes
- Préparer une série de dilution d’analyte pour Cdc37 dans la plage de concentration souhaitée. Pour la première expérience, les concentrations suivantes ont été utilisées : 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1 000 nM, 2 000 nM, 3 000 nM et 5 000 nM. Pour la deuxième expérience, un ensemble différent de concentrations allant de 0,4 nM à 200 nM a été utilisé.
- Concevez l’expérience de manière à ce qu’elle comprenne au moins huit concentrations d’analytes différentes afin d’obtenir une valeur KD fiable. Préparer les différentes dilutions de la protéine de l’analyte dans le même tampon que celui utilisé pour l’étalonnage et la protéine cible ; ici, il s’agit de 1x PBS (pH = 7,4).
4. Chargement de la puce de biocapteur activée dans le dispositif FEB
REMARQUE : Le dispositif FEB se compose d’un lecteur doté d’indications lumineuses LED et d’une cartouche pour insérer la puce du biocapteur.
- Après l’immobilisation de la protéine cible, insérez la puce activée dans la cartouche de l’appareil, qui est connectée via USB à un ordinateur. Après l’insertion de la puce, une lumière LED verte s’affichera sur le lecteur indiquant que le dispositif FEB est prêt pour l’expérience. Installez le logiciel automatisé (voir le tableau des matériaux) fourni par l’entreprise sur l’ordinateur, auquel le dispositif FEB est connecté, pour surveiller l’expérience étape par étape, comme décrit ci-dessous.
5. Exécuter l’expérience
- Appuyez sur le module Exécuter l’expérience du logiciel automatisé et choisissez 10 points avec régénération ou tout autre protocole souhaité. Remplissez les détails suivants : nom de l’opérateur, nom de l’expérience, date (par exemple, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021) ; tampon de régénération (par exemple, tampon PBS) ; la cible immobilisée (p. ex., Hsp90) ; analyte en solution (p. ex., Cdc37).
- Appuyez sur le bouton Commencer l’expérience affiché sur le logiciel et suivez les instructions affichées par le logiciel automatisé comme décrit ci-dessous.
note: Le logiciel est entièrement automatisé, convivial et guide l’utilisateur tout au long de l’expérience étape par étape. Une fenêtre contextuelle apparaîtra à l’écran avec des instructions pour continuer à chaque étape de l’expérience. Le logiciel fournira des instructions pour chaque étape répétitive consécutivement de l’étalonnage, de l’association de l’analyte, de la dissociation, de la régénération et du lavage (5x) pour chaque concentration d’analyte tout au long de l’expérience.
- Effectuer l’étalonnage de l’instrument. Pour ce faire, aspirez la solution de PBS restante de la puce et appliquez 50 μL de tampon d’étalonnage (1x PBS ; pH = 7,4). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 5 minutes jusqu’à ce que l’étape d’étalonnage soit terminée. Le logiciel affiche le point final déterminé pour l’étape d’étalonnage (5 min) avec une alarme d’avertissement pour le suivi.
- Ensuite, effectuez une association d’analyte. Pour ce faire, aspirez le tampon d’étalonnage de la puce et appliquez 50 μL de la concentration d’analyte la plus faible (25 nM de Cdc37). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 5 min jusqu’à ce que l’étape d’association soit terminée. Le logiciel affiche le point final de l’étape d’association (5 min) avec une alarme d’avertissement pour continuer.
- Effectuez une dissociation de l’analyte. Pour ce faire, aspirez la solution d’analyte de la puce et appliquez 50 μL de tampon de dissociation (1x PBS ; pH = 7,4). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 5 minutes jusqu’à ce que la durée de l’étape de dissociation (5 min) soit terminée. Le logiciel affiche le point final de l’étape de dissociation (5 min) avec une alarme d’avertissement pour le suivi.
- Ensuite, effectuez la régénération des copeaux. Aspirer la solution de dissociation de la puce et appliquer 50 μL de tampon de régénération (1x PBS ; pH = 7,4). Appuyez sur le bouton Continuer et attendez 30 s jusqu’à ce que la durée de l’étape de régénération (30 s) soit terminée. Le logiciel affiche le point final de l’étape de régénération (30 s) avec une alarme d’avertissement pour le suivi.
- Enfin, lavez la chips. Aspirez la solution de régénération de la puce et appliquez 50 μL de tampon de lavage (1x PBS ; pH = 7,4) sur la puce. Aspirez la solution de la puce et répétez l’opération 5 fois. Laissez la dernière goutte de tampon de lavage sur la puce et appuyez sur le bouton Continuer et attendez 30 s jusqu’à ce que la durée de l’étape de lavage soit terminée sur l’écran du logiciel.
REMARQUE : Le logiciel affiche le point final de l’étape de lavage (30 s) avec une alarme d’avertissement pour passer au cycle suivant de l’expérience.
- Répétez les étapes pour chaque concentration d’analyte utilisée ; les cinq étapes d’étalonnage, d’association d’analyte, de dissociation, de régénération et de lavage (5x) constituent un cycle. Pour l’expérience présentée ici, nous avons effectué 10 cycles pour 10 concentrations d’analytes (allant de 25 nM à 5 000 nM ou 0,4 nM à 200 nM ; Figure 1).
