Photométrie de masse pour étudier les interactions antigène-anticorps à l’échelle d’une seule molécule

Résumé

Source : Wu, D. et. al., Détermination rapide de l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse. J. Vis. Exp.(2021)

Dans cette vidéo, nous montrons l’utilisation de la photométrie de masse pour étudier les interactions antigène-anticorps dans une chambre d’écoulement. La lumière focalisée se diffuse différemment en fonction de la masse des molécules. Un détecteur recueille la lumière diffusée et génère le motif d’interférence sous forme de taches d’intensités variables, qui sont en corrélation avec les masses moléculaires.

Protocole

1. Préparer les chambres d’écoulement

1. Nettoyez les lamelles en verre
   1. À l’aide de flacons de lavage contenant de l’eau distillée, de l’éthanol et de l’isopropanol, rincez les lamelles de 24 mm x 50 mm dans l’ordre suivant : eau, éthanol, eau, isopropanol, eau. Séchez les lamelles avec un jet d’azote propre. Il est important de rincer les lamelles de haut en bas, en tenant le coin inférieur avec une pince à pointe souple. Séchez la lamelle dans le même sens pour éviter de transférer la contamination de la pince (Figure 1A).
   2. De même, rincez les lamelles de 24 mm x 24 mm avec de l’eau distillée, de l’éthanol et de l’eau distillée. Séchez les lamelles avec un jet d’azote propre.
   3. Identifiez le côté de travail de la lamelle, placez une goutte d’eau distillée sur la surface de la lamelle propre et suivez les étapes 3.1 à 3.2 du protocole. En règle générale, un seul côté de la lamelle de 24 mm x 50 mm possède la qualité optique adaptée aux mesures MP.
      note: Après la mise au point, aucune imperfection de surface significative ne doit être détectable et la valeur du « signal » affichée dans le logiciel de collecte de données doit être inférieure à 0,05 % (Figure 2A-C). Les côtés de travail de toutes les lamelles de la boîte sont orientés dans la même direction. La même procédure doit être utilisée pour tester l’efficacité du nettoyage des lamelles.
2. Assembler la chambre d’écoulement
   1. Placez la lamelle de 24 mm x 24 mm sur un morceau de papier d’aluminium. Placez des bandes de ruban adhésif double face sur la lamelle de 24 mm x 24 mm, comme illustré à la figure 1B, et coupez le ruban le long du bord du verre. Séparez la lamelle de la feuille d’aluminium et fixez-la sur le côté travaillant de la lamelle de 24 mm x 50 mm (Figure 1C).
      note: La taille du canal peut varier, mais une largeur de 3 mm à 5 mm est recommandée. Les canaux plus larges nécessitent des volumes d’échantillon plus importants et les canaux très étroits peuvent être difficiles à charger. Habituellement, deux canaux parallèles peuvent être facilement créés sur la lamelle de 24 mm x 24 mm. Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparer les échantillons d’anticorps-antigène pour les mesures d’affinité

1. Filtrez au moins 2 ml du tampon PBS à l’aide de filtres à seringue de 0,22 μm pour éliminer les particules de poussière ou les agrégats. Centrifuger le stock de protéines pendant 10 minutes à la vitesse maximale de la centrifugeuse de table (environ 16 000 x g).
   note: Le PBS est le tampon recommandé pour ce protocole, mais le MP n’a pas d’exigences particulières en matière de tampon, et d’autres tampons biologiques sont également acceptables. Cependant, des concentrations élevées de glycérol (>10 %) et de très faibles concentrations ioniques (concentration en sel <10 mM) peuvent affecter la qualité de l’image et des données et ne sont pas recommandées.
2. Déterminez les concentrations réelles des stocks d’anticorps et d’antigènes en mesurant leur absorbance UV de 280 nm.
3. Calculer les concentrations mesurées du mélange antigène-anticorps. Si la valeur estimée de l’affinité de liaison à l’anticorps n’est pas connue, prévoyez de préparer un échantillon avec une concentration d’antigène de 30 nM et d’anticorps de 20 nM. Lorsque l’affinité approximative est connue, le rapport anticorps/antigène et leurs concentrations doivent être optimisés en fonction des valeurs K_d attendues. Utilisez la concentration totale d’antigène dans le mélange égale à la somme du K_d attendu et de la concentration totale d’anticorps dans l’équation ci-dessous. En supposant K_d1 = K_d2 pour les deux paratopes de l’anticorps, on obtient des concentrations comparables de l’anticorps libre et des complexes anticorps-antigène dans l’échantillon.
   3. Collecter les données de photométrie de masse
   1. Appliquez une goutte d’huile d’immersion pour microscope sur l’objectif de l’instrument MP et placez la chambre d’écoulement assemblée sur la platine du microscope. Assurez-vous que l’huile s’étend sur l’espace entre la lamelle et l’objectif.
   2. Chargez la chambre d’écoulement et faites la mise au point du photomètre de masse.
      1. Déposez 10 μL d’une solution tampon propre et filtrée à une extrémité du canal de la chambre d’écoulement préparé à l’étape 1. Le liquide entrera dans le canal par capillarité.
      2. Ajustez la position Z de la platine pour focaliser le microscope sur la surface de travail de la lamelle de recouvrement de 24 x 50 mm.
         1. Dans l’onglet Contrôle de la mise au point du logiciel de collecte de données, utilisez les boutons de mouvement grossier de la platine vers le haut et vers le bas pour effectuer les premiers réglages.
         2. Cliquez sur le bouton Netteté pour afficher la lecture du signal de netteté et utilisez les boutons de réglage précis Haut et Bas pour maximiser la valeur de netteté.
         3. Cliquez sur les boutons Définir la mise au point et Verrouiller la mise au point pour activer la fonction de suivi de la mise au point. Une image correctement mise au point (Figure 2A, C) doit avoir une valeur de « signal » inférieure à 0,05 %.
            note: Si la valeur du « signal » à la position de netteté maximale est supérieure à 0,05 %, cela peut indiquer des impuretés sur la surface du verre ou dans le tampon.
   3. À l’aide du même canal, chargez 20 μL de l’échantillon d’anticorps-antigène en le déposant d’un côté du canal et en épongeant le liquide de l’autre extrémité avec un petit morceau de papier buvard (Figure 1D).
      note: Le volume d’un canal de 3 à 5 mm de large est d’environ 10 μL. Le volume d’échantillon supplémentaire est recommandé pour remplacer complètement le tampon présent dans le canal et pour éviter la dilution de l’échantillon.
   4. Après avoir chargé l’échantillon, cliquez immédiatement sur le bouton Enregistrer pour lancer la collecte de données et acquérir une vidéo de 100 s (Figure 2D).
   5. À la fin de la collecte de données, entrez le nom du fichier et cliquez sur OK pour enregistrer le fichier de données.
   6. Jetez les lamelles et essuyez l’huile de l’objectif avec des cotons-tiges optiques imbibés d’isopropanol.
      note: Le protocole peut être mis en pause ici.

   4. Analyser les données MP

   1. Traiter le fichier vidéo recueilli à l’aide du logiciel de traitement des données MP pour identifier les événements d’atterrissage.
      1. Utilisez l’option de menu Fichier/Ouvrir pour charger le fichier pour l’analyse et cliquez sur Analyser.
      2. Cliquez sur le bouton Charger pour charger la fonction d’étalonnage et enregistrer les données analysées à l’aide de l’option de menu Fichier/Enregistrer les résultats sous.
   2. Ajustez la distribution de masse moléculaire avec des fonctions gaussiennes pour obtenir les concentrations relatives de chaque espèce dans l’échantillon. Cette analyse peut être effectuée à l’aide d’un logiciel de représentation graphique scientifique courant (voir Tableau des matériaux).
      1. Importez le fichier « eventsFitted.csv » dans le logiciel et tracez la distribution de masse moléculaire (colonne M dans le fichier .csv) à l’aide de la fonction Plot/Statistics/Histogram.
      2. Double-cliquez sur l’histogramme pour ouvrir la fenêtre Propriétés du tracé. Désactivez le regroupement automatique et sélectionnez une taille de bac de 2,5 kDa. Cliquez sur les boutons Appliquer et Aller pour créer les données Centres d’emplacement et Comptages.
      3. Sélectionnez les colonnes Centres de groupe et Comptages et utilisez la fonction de menu Analyse/Pics et Ajustement de base/Crêtes multiples pour ajuster l’histogramme avec des fonctions gaussiennes. Double-cliquez pour indiquer les positions de crête approximatives sur le graphique de distribution, puis cliquez sur le bouton Ouvrir NLFit.
      4. Cochez les cases Fixe pour les centres de pic « xc » et définissez leurs valeurs sur les masses moléculaires attendues de l’anticorps libre et des complexes antigène-anticorps simple et double. Vérifiez l’option Partager pour les paramètres de largeur. Cliquez sur le bouton Ajuster. Les valeurs de hauteur de pic ajustées des composantes gaussiennes représentent la concentration relative de chaque espèce dans l’échantillon.
         note: La taille du bac peut être ajustée pour optimiser la résolution du graphique de distribution de masse. La limite de précision MP est d’environ 1 kDa, et des bacs plus petits peuvent amplifier le bruit de la distribution, sans révéler d’informations supplémentaires. Des bacs de très grande taille masqueront les détails fins des distributions de masse.
   3. Calculer la fraction de concentration de chaque espèce à l’aide de l’équation suivante :
      

Résultats

Figure 1 : Préparation et chargement de la chambre d’écoulement MP. (A) Position de maintien de la lamelle pour la procédure de nettoyage. (B) Alignement de la lamelle de recouvrement de 24 x 24 mm (couche intermédiaire) et du ruban adhésif double face (couche supérieure) sur la surface de la feuille d’aluminium (couche inférieure, non illustrée). Les lignes p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AcquérirMP	Refeyn		Logiciel de collecte de données MP
Thrombine anti-humaine	Technologies hématologiques	AHT-5020	Numéro de référence : AB_2864302
Applicateurs à embout de coton	Thorlabs	CTA10	Cotons-tiges optiques pour le nettoyage des verres
Lamelles de recouvrement 24x24 mm	Globe Scientific	Référence 1405-10
Lamelles de recouvrement 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DécouvrirMP	Refeyn		Logiciel de traitement des données MP
forceps	Sciences de la microscopie électronique	Référence 78080-CF	Pince à embout souple pour la manipulation des lamelles
α-thrombine humaine	Technologies hématologiques	HCT-0020
Huile d’immersion	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	Référence 36644
Fichier Microsoft Excel	Microsoft		tableur
OneMP	Refeyn		Instrument de photométrie de masse
origine	Laboratoire d’origine		Logiciel de graphisme scientifique
Pbs	Corning	46-013-CM	10x stock
Filtre à seringue	Millipore	SLGSR33SS	Filtrage des tampons et des échantillons