1. Préparation du tampon d’agarose (Figure 1)
- Placez une lame de verre de microscope sur une surface plane et horizontale. Disposez deux lames de verre surmontées de deux couches de ruban adhésif de chaque côté de la diapositive initiale.
note: Gardez un espace de 1 à 2 mm entre les trois lames alignées pour éviter que l’agarose fondue ne finisse par se répandre sur les lames avec du ruban adhésif.
- Pipeter et verser une gouttelette de 70 μL d’agarose fondu à 1 % sur la lame de verre. Ajoutez une quatrième diapositive sur le dessus pour aplatir la gouttelette d’agarose et appuyez doucement. Attendez environ une minute.
- Retirez la lame supérieure et déposez-la à l’aide d’une pipette d’environ 3 μL de bactéries en 3 à 4 endroits à différents endroits sur le tampon d’agarose.
- Couvrir avec une lamelle en verre de microscopie (par exemple une épaisseur de 22x22 mm #1.5).
note: La planéité et l’épaisseur des lamelles sont importantes pour travailler avec des excitations à deux photons. Les lamelles de précision avec une planéité uniforme contrôlée et une faible autofluorescence sont généralement un bon choix.
- Fixez la lamelle avec de la paraffine fondue pour sceller la lamelle sur la lame de verre. Commencez par fixer les quatre coins de la lamelle.
2. Imagerie avec une configuration de microscopie à deux photons
REMARQUE : Nous utilisons un microscope inversé à balayage à excitation à deux photons fait maison avec un objectif à immersion dans l’eau 60x 1.2NA fonctionnant en mode de collecte de fluorescence dé-balayé. La longueur d’onde d’excitation à deux photons est fixée à 930 nm. Il est fourni par un laser Ti :Sapphire (taux de répétition de 80 MHz, largeur d’impulsion de ≈ 70 fs) fonctionnant à 10-20 mW. Les photons de fluorescence ont été collectés à travers un filtre passe-court de 680 nm et un filtre passe-bande de 525/50 nm avant d’être dirigés vers une photodiode d’avalanche couplée à une fibre connectée à un module de comptage de photons uniques corrélés dans le temps (TCSPC). Le microscope est également équipé d’une lampe à fluorescence à transmission. Plusieurs microscopes FLIM-FRET sont maintenant disponibles dans le commerce et de nombreuses installations d’imagerie sont équipées de configurations capables d’effectuer des mesures FLIM-FRET.
- Utilisez la lampe à fluorescence pour focaliser l’objectif sur la monocouche de bactéries dans l’échantillon et sélectionner les régions d’intérêt.
- Vérifiez que l’obturateur laser d’excitation est fermé et que la lumière infrarouge provenant du laser est bloquée et ne pénètre pas dans le microscope.
prudence: Une attention particulière et une vigilance constante doivent être accordées en travaillant avec des lasers pulsés IR car la lumière laser ne peut pas être vue par les yeux, mais toute exposition directe ou réflexion laser, même transitoire, peut être extrêmement nocive et créer des lésions oculaires irréversibles. Veuillez vous référer aux procédures de sécurité laser locales et à la formation avant d’utiliser des configurations de microscopie.
- Placez la lame de microscopie sur la platine avec les lamelles face à l’objectif.
- Vérifiez que la lampe de fluorescence est allumée.
- Tournez la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube eGFP et ouvrir l’obturateur de la lampe à fluorescence.
- Envoyez la lumière de fluorescence vers l’oculaire du microscope.
Attention : Assurez-vous que les filtres appropriés sont éliminés dans le trajet lumineux pour éliminer la lumière à excitation directe provenant de la lampe à fluorescence qui peut endommager les yeux.
- Focalisez l’objectif sur les bactéries à l’aide du bouton du microscope.
- Sélectionnez une région d’intérêt dans l’échantillon en la transmettant à l’aide du joystick contrôlant la platine motorisée
note: La mise au point est plus facile avec des échantillons hautement fluorescents, ce qui permet de voir la fluorescence directement avec les yeux.
- Commutez l’excitation du laser 2PE pour les mesures FLIM-FRET.
- Renvoyez le chemin d’émission de fluorescence vers le détecteur.
- Retournez la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube dichroïque pour le laser de 930 nm.
- Réglez la puissance laser sur 20 mW.
- Définissez la taille de la région d’intérêt sur 30 μm. Cette opération ajuste la tension de fonctionnement des galvo-miroirs et définit l’amplitude de leurs mouvements (Figure 2).
- Allumez le détecteur et commencez à scanner l’échantillon - les boutons de démarrage et d’arrêt contrôlant le balayage contrôlent également l’ouverture et la fermeture de l’obturateur laser, à la fois pour des raisons de sécurité et pour limiter le photoblanchiment de l’échantillon (Figure 2).
- Si nécessaire, ajustez la mise au point en déplaçant légèrement le bouton de mise au point fine du microscope.
- Choisissez le champ de vision pour l’imagerie en déplaçant finement la platine depuis l’interface de l’ordinateur. Cela peut être fait sur la configuration en déplaçant la croix sur l’image dans le logiciel de contrôle du microscope (Figure 2) qui définira le nouveau centre de l’image et en appuyant sur « Move Stage ». Un bon champ de vision pour l’acquisition correspond à une image avec 10 à 30 bactéries immobiles, toutes correctement mises au point (toutes les bactéries sont sur le même plan). Si vous souhaitez extraire des données FLIM-FRET de cellules uniques, assurez-vous que les bactéries sont bien individualisées (la segmentation des images sera beaucoup plus facile).
