Essai d’agrégation cellulaire pour détecter les interactions trans entre les molécules d’adhésion cellulaire

Résumé

Source : Restrepo, S., et al., Mesure des interactions transcellulaires par agrégation de protéines dans un système cellulaire hétérologue. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique permettant de mesurer les interactions transcellulaires entre les molécules d’adhésion des cellules synaptiques grâce au test d’agrégation cellulaire HEK. Dans ce test, un nombre égal de cellules HEK exprimant une molécule d’adhésion cellulaire présynaptique souhaitée et une protéine fluorescente sont mélangés avec des cellules HEK exprimant une molécule d’adhésion cellulaire post-synaptique et une autre protéine fluorescente. L’interaction entre les molécules d’adhésion cellulaire force les cellules à s’agréger, ce qui peut être mesuré par microscopie à fluorescence.

Protocole

1. Culture cellulaire et transfection

1. Faites des milieux cellulaires HEK avec du DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) complété par 4,5 g / L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium, et 10 % de FBS. Filtre stérile.
2. Prédéterminer les ligands et les récepteurs appropriés pour le test d’agrégation.
   note: Neurexin3α SS4+/- et l’un de ses ligands connus, LRRTM2, ont été utilisés dans cette étude. Les ligands et les récepteurs d’intérêt ont été exprimés à partir d’ADNc dans l’ADNpc3.1. Un assemblage Gibson a été utilisé pour insérer Neurexin3α dans pcDNA3.1. Neurexin3α F/R :
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Préparez HEK293T cellules.
   1. Faites croître HEK293T cellules jusqu’à la confluence dans une fiole T-75.
   2. Une fois confluent, utilisez 2 ml de trypsine et placez-le dans un incubateur à 37 °C pendant 2 min. Ajoutez 6 ml de milieu HEK dans le ballon pour remettre les cellules en suspension et transférez les 8 ml dans un tube conique de 15 ml.
   3. Granuler à 500 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans un milieu cellulaire HEK pour un total de 8 mL.
   4. Comptez les cellules et ajoutez 735 000 cellules dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Ajustez le volume final à 2 mL pour chaque puits à l’aide d’un milieu cellulaire HEK.
   5. Placez-le dans un incubateur à 37 °C et laissez les cellules se développer pendant la nuit ou jusqu’à ce qu’elles atteignent 50-60 % de confluence.
4. Transfectez HEK293T cellules à l’aide de la méthode du phosphate de calcium.
   1. Transfect well-1 avec 3 μg de la protéine d’intérêt et co-transfect avec 1 μg de protéine fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- et 1 μg de mCherry).
   2. Transfect well-2 comme à l’étape 1.4.1. mais avec la protéine mutée d’intérêt (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfect well-3 avec 3 μg du ligand d’intérêt et co-transfect avec 1 μg d’une autre protéine fluorescente (3 μg d’ADNpc3.1 LRRTM2 et 1 μg de GFP).
   4. Transfectez le puits 4 et le puits 5 pour servir de témoins négatifs : le puits 4 avec 1 g de GFP et le puits 5 avec 1 g de cerises métalliques.
   5. Préparez une autre plaque (comme aux étapes 1.4.1-1.4.4) si vous avez besoin de conditions ou de contrôles supplémentaires (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      note: L’efficacité de la transfection est analysée 24 h après la transfection au microscope à épifluorescence et quantifiée comme le nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente avec laquelle elles ont été transfectées. Une approche plus rationalisée inclurait la transfection de cellules HEK avec un vecteur bicisternique codant pour une protéine fluorescente et le ligand d’intérêt, et est fortement recommandée par rapport à la co-transfection. Dans le cas de cette étude, les neurexines alpha pèsent ~4,3 kb et une faible intensité de fluorescence a été observée à l’aide d’un système bicisternique nécessitant une co-transfection.
5. 48 heures après la transfection, récoltez les cellules pour l’agrégation.
   1. Lavez bien chaque fois avec du PBS.
   2. Ajouter 1 mL de 10 mM d’EDTA dans du PBS dans chaque puits pour dissocier doucement les interactions entre cellules et incuber la plaque à 37 °C pendant 5 min
      note: La trypsine n’est pas recommandée pour l’étape 1.5.b en raison du clivage protéolytique potentiel des molécules d’adhésion dans l’étude. De plus, après l’ajout de l’EDTA, le protocole ne peut pas être arrêté avant la fin de la course, car les cellules seront désormais exposées aux conditions ambiantes.
   3. Tapotez doucement la plaque pour détacher les cellules et récoltez chaque puits dans des tubes coniques séparés de 15 ml.
   4. Centrifuger les tubes coniques à 500 x g et à température ambiante pendant 5 min.
6. Pendant que les cellules sont en granulation, préparez 6 tubes d’incubation en étiquetant le haut de chaque tube de microcentrifugation avec chaque condition.
   note: Chaque permutation des conditions GFP et mCherry doit être utilisée pour englober toutes les conditions expérimentales et les contrôles appropriés. Par exemple : 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Fabriquer des tubes supplémentaires pour s’adapter à d’autres conditions et contrôles.
7. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 μL de milieu HEK avec 10 mM de CaCl₂ et 10 mM de MgCl₂ chauffés à 37 °C
   note: L’ajout de CaCl₂ et de MgCl₂ permet aux molécules d’adhésion de rétablir leur liaison et n’est nécessaire que si les partenaires d’interaction transcellulaire en question nécessitent des cations divalents pour l’adhésion.
8. Compter les cellules de chaque tube conique de 15 mL à l’aide d’un hémocytomètre et aliquote de 200 000 cellules de chaque affection dans un tube approprié à partir de l’étape 1.6 pour un mélange 1:1 dans un volume total de 500 μL.
   note: Cela ne devrait prendre que 5 minutes par condition pour compter et aliquote les quantités.
9. Incuber les tubes à température ambiante dans un rotateur de tube lent.

2. Acquisition d’images

1. Optimisez les paramètres d’acquisition du microscope pour des échantillons spécifiques. Dans cet exemple, les images ont été prises à l’aide d’un microscope à grand champ. Utilisez un objectif aérien 5x (NA : 0,15 ; WD : 20000 μm) pour obtenir un champ suffisamment grand pour l’analyse.
2. Évaluez l’agrégation de base immédiatement après avoir mélangé les deux conditions des cellules HEK à l’étape 1.8. Ce sont maintenant les images du « temps zéro ».
   1. Pipeter 40 μL de chaque mélange d’échantillons sur une lame de microscope chargée et imager sous fluorescence dans les canaux 488 et 561.
   2. Acquérez trois champs de vision différents sur un seul plan de mise au point par chute d’échantillon.
3. Acquérez les images finales à 60 min en tant qu'image « temps 60 ».
   1. Pour obtenir l'image « temps 60 » du mélange après une incubation de 60 minutes, prélever un autre échantillon de 40 μL de chaque condition à partir de tubes rotatifs et pipeter chaque échantillon sur une lame chargée. Image comme à l’étape 2.2.
      note: L’agrégation des cellules doit être vérifiée toutes les 15 minutes jusqu’à saturation. Le moment de l’agrégation dépendra des protéines testées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes jetables de 5 ml avec bouchons à pression	VWR	Référence 89000-028	Incubation d’une population mixte de cellules HEK
Unité de filtration à débit rapide de 1000 ml, membrane aPES de 0,2 μm	Thermo Fisher	Référence 567-0020	Stérilisation des milieux HEK
Tubes à centrifuger SpectraTube de 15 ml	La science de Ward	Référence 470224-998	Récolte de cellules HEK
Plaques de culture de tissus stériles à 6 puits	VWR	Référence 100062-892	Culture de cellules HEK
Chlorure de calcium	sigma	Référence 223506-500G	Transfection de phosphate de calcium, remise en suspension de cellules HEK
Centrifugeuse - Sorvall Legend RT	Produits de laboratoire Kendro	75004377	Récolte de cellules HEK
Incubateur à cellules CO2	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubation des cellules HEK pendant la croissance
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) avec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium	Corning	10-013-CV	Maintenance des cellules HEK
Saline tamponnée au phosphate PBS de Dulbecco (1X)	Gibco	Référence 14190 à 144	Passage et récolte de cellules HEK
Acide éthylènediaminetétraacétique	sigma	ED-500G	Récolte de cellules HEK
Falcon Flacons de culture ventilés, surface de croissance de 75cm2	Corning	Référence 9381M26	Culture de cellules HEK
Sérum fœtal bovin	sigma	17L184	Maintenance des cellules HEK
HEK293T cellules	ATCC		Système de modèle
ImageJ	Nih	V : 2.0.0-rc-69/1.52p	Analyse d’images
Chlorure de magnésium hexahydraté	sigma	Référence M9272-500G	Resuspension de cellules HEK
Phosphate dibasique de sodium anhydre	Bioréactifs Fisher	Réf. BP332-500	Transfection de phosphate de calcium
Trypsine à 0,25 % (1X) Solution	GE Healthcare Sciences de la vie	SH30042.01	Passage des cellules HEK
Rotateur de tube			Incubation d’une population mixte de cellules HEK
Lames de microscope UltraClear. Blanc givré, chargé positivement	Denville Scientific Inc.	Référence M1021	Acquisition d’images
Microscope à grand champ	Zeiss	Axio Vert 200M	Acquisition d’images