REMARQUE : Ce protocole utilise des souches de C. elegans dans lesquelles des partenaires d’interaction potentiels sont tous deux marqués. Il est fortement recommandé d’utiliser une souche témoin négative, dans laquelle une protéine marquée ne devrait pas interagir avec un autre partenaire d’interaction candidat marqué. Ici, la GFP seule a été utilisée comme contrôle négatif pour évaluer le bruit de fond, car DLC-1 ne devrait pas interagir avec la GFP dans le ver. L’OMA-1 marquée à la GFP a été utilisée comme souche expérimentale, car les données préliminaires suggèrent une interaction avec la DLC-1. Les souches de nématodes co-exprimant les protéines de contrôle et d’essai avec DLC-1 marquées 3xFLAG sont désignées dans le présent texte sous le nom de 3xFLAG ::D LC-1 ; GFP et 3xFLAG ::D LC-1 ; OMA-1 ::GFP (souches disponibles sur demande ; plus d’informations dans la table des matériaux), respectivement. Ici, les balises 3xFLAG et GFP sont utilisées ; cependant, d’autres marqueurs peuvent être substitués à condition que leurs anticorps soient compatibles avec les réactifs du kit PLA.
1. Soins aux animaux
- Conservez les vers sur des plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM) qui sont ensemencées avec la souche OP50 d’E. coli et maintenez-les à 24 °C pour une expression optimale de la GFP.
- Passage des vers adultes tous les 2-3 jours pour propager les vers et les garder bien nourris.
2. Préparation de la culture synchrone
- Synchronisez les vers en blanchissant une plaque d’hermaphrodites gravides bien nourris. Un protocole de blanchiment est décrit dans Porta-de-la-Riva et al. Laissez les embryons éclore pendant la nuit dans un tube à centrifuger à 24 °C tout en tournant d’un bout à l’autre dans 10 mL de tampon M9 minimal (M9). Cela produira une culture de larves L1 arrêtées.
- Incuber le tube des larves arrêtées au stade L1 sur de la glace pendant 10 min, puis compléter le tube avec de la glace 1x M9.
- À l’aide d’une centrifugeuse, granulez les larves à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant de manière à ce qu’il ne reste que 1 à 2 ml de surnageant.
- Remettre la pastille de larves en suspension et à l’aide d’une micropipette, transférer 2 μL de culture de larves en suspension sur une lame de verre. Comptez le nombre de larves présentes pour déterminer la densité de la culture de larves, ce qui aidera à guider l’ensemencement des vers à l’étape 2.5.
note: Une densité de 10 à 15 larves L1/1 μL convient bien à l’ensemencement.
- À l’aide d’une micropipette, transférez le volume de culture larvaire nécessaire pour ensemencer environ 100 à 120 larves de stade L1 sur une plaque OP50 de 60 mm. Par exemple, semez 10 μL d’une culture de larves qui a une densité de 10 larves L1/1 μL de culture.
note: Ne dépassez pas un volume de 40 μL pour ensemencer les larves, sinon un excès de liquide perturbera la pelouse OP50. Si le volume de culture dépasse 40 μL, répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour réduire davantage le volume et augmenter la densité de la culture de larves.
- Cultivez les vers à 24 °C. Notez le moment où les L1 sont ensemencés sur la plaque et vérifiez périodiquement le stade de développement pour identifier le moment idéal pour la dissection.
note: 52 h après l’ensemencement des L1, les vers cultivés à 24 °C sont généralement au stade de jeune adulte, qui est le stade idéal pour la dissection du PLA ciblant les gonades. Cependant, le moment réel où les vers synchronisés atteignent le stade de jeune adulte peut varier selon les souches et la température d’incubation.
3. Dissection/extrusion de gonades
REMARQUE : La dissection pour extruder la gonade est nécessaire pour que le PLA ciblé sur les gonades fonctionne correctement. Cette approche peut également libérer des embryons, qui fonctionnent également en utilisant ce protocole pour le PLA (voir la discussion pour plus d’informations). Après la dissection, les échantillons de contrôle négatif et les échantillons expérimentaux sont fixés et traités ensemble pour le PLA en parallèle. Il est également suggéré de préparer un ensemble supplémentaire d’échantillons à des fins de co-immunomarquage fluorescent afin de mettre en évidence les profils d’expression des partenaires protéiques d’intérêt.
- Prélever 30 à 40 jeunes vers adultes dans un plat en verre de montre contenant 500 μL de 1x M9 + lévamisole (concentration finale de 2,5 mM). Après avoir collecté les vers, retirez et jetez soigneusement la plupart des milieux pour éliminer les bactéries qui sont transférées avec les vers.
- Ajoutez 500 μL frais de 1x M9 + lévamisole et utilisez la pipette pour aspirer et distribuer doucement le milieu pour rincer les vers. Retirez et jetez soigneusement la plupart des supports pour éliminer les bactéries qui sont transférées avec les vers.
- Répétez cette étape 2 à 3 fois jusqu’à ce que toutes les bactéries soient éliminées. Une fois les lavages terminés, laissez les vers dans environ 100 μL de milieu pour rester hydratés.
note: Ne laissez pas les vers rester dans le milieu pendant plus de 7 minutes, car cela nuirait à l’extrusion des gonades pendant la dissection. Effectuez des lavages à l’aide d’un microscope à dissection pour surveiller l’élimination des milieux afin de ne pas perdre de vers.
- À l’aide d’une pipette en verre ou en polyéthylène, transférez les vers sur une lame de microscope de 25 mm x 75 mm recouverte de poly-L-lysine à 0,001 % (les lames utilisées dans cette procédure ont un périmètre recouvert d’époxy, laissant trois espaces de travail de 14 mm x 14 mm chacun). Retirez l’excédent de média de manière à ce qu’il reste environ 10 à 15 μL de support.
- À l’aide d’un microscope à dissection et à l’aide de deux aiguilles de calibre 261/2, placez une aiguille sur l’autre de manière à ce que les extrémités forment une paire de ciseaux. À l’aide d’aiguilles orientées de cette manière, coupez les vers derrière le pharynx pour libérer les lignées germinales. Disséquez tous les vers en moins de 5 minutes.
note: Plus de détails sur la façon de réaliser des dissections peuvent être trouvés dans une publication précédente de Gervaise et Arur.
- Une fois que tous les vers ont été disséqués, placez délicatement une lamelle de 22 mm x 40 mm sur la lame de manière à ce qu’elle soit perpendiculaire à la lame. Les extrémités de la lamelle doivent pendre de la glissière.
- Congelez les lames sur un bloc d’aluminium pré-refroidi maintenu sur de la glace sèche pendant au moins 20 min. Placez délicatement un crayon réfrigéré sur le dessus de la lamelle pour éviter que celle-ci ne se détache en raison de l’expansion de la glace.
4. Fixation/blocage
- Lorsque vous êtes prêt à fixer, retirez les lamelles à l’aide d’un crayon ou d’un autre outil à tranchant émoussé et trempez immédiatement la lame dans un bocal contenant du méthanol frais et glacé (refroidi à -20 °C) pendant 1 min.
- Essuyez doucement les bords de la lame qui entourent l’échantillon afin que le réactif suivant soit maintenu par la tension superficielle autour de l’échantillon. Appliquer 150 μL de fixateur (2 % de formaldéhyde dans 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) pendant 5 min à RT.
note: Nous avons également testé une procédure de fixation méthanol/acétone et avons constaté qu’elle est compatible avec la réaction PLA.
- Touchez la glissière sur une serviette en papier à un angle perpendiculaire de 90° pour laisser le fixateur s’écouler de la diapositive et absorber dans l’essuie-tout. Bloc lames 2x pendant 15 min à RT dans un bocal Coplin avec 50 mL de 1x PBS/1 % Triton X-100/1 % d’albumine sérique bovine (PBT/BSA).
note: Les bocaux Coplin ou d’autres types de bocaux de coloration sont recommandés pour cette étape de blocage et les étapes de lavage ci-dessous dans les sections 6 à 9. Ceux-ci fournissent des volumes suffisants pour un échange efficace du tampon de blocage ou de lavage avec l’échantillon.
- Bloquez les lames avec une solution PBT/BSA contenant 10 % de sérum de chèvre normal. Essuyez doucement les bords qui entourent la lame et appliquez 100 μL de la solution sur la lame. Incuber pendant 1 h à RT dans une chambre humide.
note: Cette étape est fortement recommandée pour la coloration avec l’anticorps primaire αFLAG. La chambre humide est construite en fixant des pipettes en verre avec du ruban adhésif dans le plateau pour que les lames puissent être posées pendant l’incuber. Des lingettes humides (table des matériaux) sont placées dans le plateau pour augmenter l’humidité interne du plateau afin d’éviter l’évaporation. Le couvercle et le plateau sont recouverts d’une feuille d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière pendant les étapes sensibles à la lumière.
- Placez la diapositive sur une serviette en papier pour laisser la solution PBT/BSA/10 % NGS s’écouler de la diapositive et essuyez doucement les bords de la diapositive. Utilisez le réactif de blocage (Table des matériaux) pour bloquer les lames. Appliquez une goutte dans l’espace de 14 mm x 14 mm. Incuber les lames pendant 1 h à 37 °C dans une chambre humide.
5. Incubation primaire de l’anticorps
REMARQUE : Pour obtenir les meilleurs résultats de PLA et un bruit de fond minimal, le facteur de dilution des anticorps primaires peut nécessiter une optimisation (voir la discussion pour plus de détails). De plus, les anticorps primaires doivent être élevés chez différents hôtes qui correspondent à la spécificité des anticorps secondaires utilisés pour le PLA.
- Placez la lame sur une serviette en papier pour laisser le réactif de blocage s’écouler de la lame et essuyez doucement les bords. Utilisez le diluant d’anticorps (Table des matériaux) pour diluer les anticorps primaires. Appliquer 40 μL de solution d’anticorps primaires par espace de 14 mm x 14 mm.
- Incuber les lames dans une chambre humide pendant la nuit à 4 °C.
6. Incubation de la sonde PLA (anticorps secondaire)
REMARQUE : Pour les étapes 6 à 9, utilisez les tampons de lavage A et B à RT. Si les tampons sont stockés à 4 °C, laissez-les chauffer à RT avant de les utiliser.
- Laver les lames 2x pendant 5 min avec 50 mL de 1x tampon de lavage A (table des matériaux) à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un agitateur orbital réglé à 60 tr/min.
- Placez la diapositive sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’écouler de la diapositive et essuyez doucement les bords. Préparez une solution de 40 μL contenant des sondes PLUS et MOINS (diluées 1:5 avec un diluant d’anticorps). Appliquez la solution dans chaque espace de 14 mm x 14 mm.
- Incuber les lames dans une chambre humide pendant 1 h à 37 °C.
7. Ligature
- Laver les lames 2x pendant 5 min avec 50 mL de 1x tampon de lavage A à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un agitateur orbital réglé à 60 tr/min.
- Diluez le tampon de ligature (tableau des matériaux) 1:5 avec de l’eau ultra-pure. Utilisez ce tampon pour diluer la ligase (Table des matériaux) 1:40 afin de préparer un stock de travail de solution de ligature.
- Placez la diapositive sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’écouler de la diapositive et essuyez doucement les bords. Appliquez 40 μL de la solution de ligature dans chaque espace de 14 mm x 14 mm.
- Incuber les lames dans une chambre humide pendant 30 min à 37 °C.
8. Amplification
REMARQUE : L’utilisation de réactifs de détection avec des fluorophores rouges (Table des matériaux) permet d’obtenir le moins de bruit de fond dans les tissus de C. elegans.
- Laver les lames 2x pendant 5 min avec 50 mL de 1x tampon de lavage A à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un agitateur orbital réglé à 60 tr/min.
- Diluez le tampon rouge d’amplification (tableau des matériaux) 1:5 avec de l’eau ultrapure. Utilisez ce tampon pour diluer la polymérase (Table des matériaux) 1:80 afin de préparer un stock de travail de solution d’amplification et de protéger de la lumière.
- Placez la diapositive sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’écouler de la diapositive et essuyez doucement les bords. Appliquez 40 μL de la solution d’amplification dans chaque espace de 14 mm x 14 mm.
- Incuber les lames dans une chambre humide pendant 1 h et 40 min à 37 °C. Assurez-vous que la chambre humide est recouverte d’une feuille pour protéger les échantillons de la lumière.
9. Lavages finaux
- Laver les lames 2x pendant 10 min avec 50 mL de 1x tampon de lavage B (Table des matériaux) à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un agitateur orbital réglé à 60 tr/min.
- Laver les lames 1x pendant 1 min avec 50 mL de tampon de lavage 0,01x B à RT dans un bocal Coplin. Réglez le pot Coplin sur un agitateur orbital réglé à 60 tr/min. Ce tampon est préparé en diluant le tampon de lavage B avec de l’eau ultra-pure.
10. Montage de la lamelle
- Laissez l’excès de tampon de lavage s’écouler de la diapositive sur une serviette en papier et essuyez tout tampon résiduel restant sur le périmètre enduit d’époxy de la diapositive.
- Ajoutez 10 μL de support de montage (tableau des matériaux) à l’échantillon et posez doucement une lamelle sur le dessus, permettant au support de montage de s’étaler.
- Peignez le bord de la lamelle avec du vernis à ongles pour sceller la lamelle et glissez-la. Soyez doux avec l’application du vernis à ongles pour éviter de déplacer la lamelle, ce qui endommagerait les lignes germinales. Laissez le vernis durcir pendant au moins 20 min à RT, à l’abri de la lumière, avant de le visualiser au microscope.
