1. Immunoprécipitation
REMARQUE : Nous avons utilisé un tampon de lyse au dodécylsulfate de sodium (SDS) et une élution au citrate, comme décrit dans les sections suivantes. Cependant, l’utilisation d’une autre technique d’immunoprécipitation interne peut également s’appliquer à la préparation d’échantillons de LC-MS/MS.
- Cellules cultivées par transfection avec des vecteurs codant pour une étiquette d’épitope seule ou une protéine de fusion. Pour obtenir des données représentatives, transférez des cellules J774 (1 x 106) avec des vecteurs codant pour une protéine fluorescente verte (GFP) seule ou Capn6 fusionnée à la GFP (gène calpaïne-6) à l’aide de liposomes cationiques.
- Anticorps conjugué aux billes magnétiques.
- À cette fin, mélangez l’anticorps anti-GFP (2 μL/réaction) avec des billes magnétiques (25 μL/réaction) dans 500 μL de tampon phosphate de citrate (24,5 mM d’acide citrique, 51,7 mM de phosphate de sodium dibasique ; pH 5,0) dans un tube à essai de 1,5 mL.
- Faites tourner le mélange à 50 tr/min pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, laver trois fois les billes conjuguées aux IgG avec un tampon phosphate de citrate contenant 0,1 % de monolaurate de polyoxyéthylène (20) sorbitan.
- Lyser les cellules transfectées à l’aide d’un tampon de lyse approprié. Pour obtenir des données représentatives, lyser les cellules transfectées pendant 30 min sur glace dans 400 μL de tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl ; pH 7,5, 120 mM de NaCl, 0,5 % de poly(oxyéthylène) octylphényléther ) contenant 40 μmol/L de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 50 μg/mL de léupeptine, 50 μg/mL d’aprotinine, 200 μmol/L d’orthovanadate de sodium, et 1 mM d’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA) dans des tubes à essai de 1,5 mL 24 h après la transfection.
- Éliminez le lysat en le centrifugant à 15 000 x g pendant 5 min et récupérez le surnageant.
- Pré-éclairez le lysat. Ajouter des billes magnétiques non étiquetées (25 μL/réaction) dans un tube à essai de 1,5 mL. Lavez les billes trois fois avec 500 μL de tampon de phosphate de citrate. Après avoir retiré le tampon de phosphate de citrate lors du lavage final, ajoutez le lysat cellulaire sur les billes magnétiques. Faites pivoter le mélange à l’aide d’un rotateur à 50 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
- Placez le tube à essai sur un support magnétique pendant 5 minutes pour la séparation magnétique, et récupérez le lysat cellulaire. L’utilisation du support magnétique désigné par le fabricant est recommandée.
- Lier les protéines cibles aux billes conjuguées. Placez les billes d’immunoglobulines (Ig)G conjuguées sur un support magnétique pendant 5 minutes pour la séparation magnétique, jetez le tampon de citrate, puis ajoutez le lysat cellulaire aux billes séparées.
- Faites tourner le mélange à 50 tr/min pendant 1 h à température ambiante.
- Séparez les protéines cibles des protéines non cibles libres. Laver les billes trois fois à l’aide de 500 μL de tampon phosphate de citrate contenant 0,1 % de monolaurate de polyoxyéthylène (20) sorbitan. Après le lavage final, ajoutez 30 μL de tampon de citrate (pH 2-3) et incubez pendant 5 min à température ambiante pour éluer les protéines cibles.
note: Si la récupération de l’immunoprécipitation est insuffisante, l’utilisation d’autres marqueurs d’épitopes, tels que FLAG ou HIS, peut améliorer l’efficacité. Si l’efficacité de l’élution est insuffisante, l’utilisation d’autres éluants, tels qu’une solution basée sur une FDS, peut améliorer l’efficacité.
2. Digestion sur membrane des protéines
REMARQUE : L’utilisation de matériaux et d’équipements sans protéines est nécessaire pour éviter la contamination par des protéines exogènes. De plus, il est recommandé à l’opérateur de porter un masque chirurgical et des gants pour éviter la contamination par les protéines humaines.
- Coupez les membranes PVDF en morceaux de 3 mm x 3 mm à l’aide de ciseaux chirurgicaux qui ont été essuyés avec du méthanol et séchés immédiatement avant utilisation.
- Ajoutez 2 à 5 μL d’éthanol aux morceaux de membrane PVDF sur du papier d’aluminium propre.
- Avant qu’elles ne sèchent complètement, ajoutez l’éluant (2 à 5 μL chacun, 4 à 6 morceaux par échantillon) sur les membranes PVDF hydrophiles, puis faites sécher les membranes à l’air libre jusqu’à ce que la surface de la membrane devienne mate. Les membranes séchées peuvent être stockées à 4 °C.
- Transférez toutes les membranes dans des tubes en plastique de 1,5 ml, ajoutez 20 à 30 μL d’éthanol pour rendre les membranes hydrophiles, puis retirez l’éthanol à l’aide d’une pipette.
- Avant que la membrane ne sèche complètement, ajoutez 200 μL de solution réactionnelle à base de dithiothréitol (DTT) (80 mM de NH4HCO3, 10 mM de DTT et 20 % d’acétonitrile) et incubez-la à 56 °C pendant 1 h.
- Remplacer la solution réactionnelle par 300 μL de solution d’iodoacétamide (80 mM NH4HCO3, 55 mM d’iodoacétamide et 20 % d’acétonitrile) et incuber pendant 45 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Lavez les membranes deux fois avec 1 mL d’eau distillée et une fois avec 1 mL d’acétonitrile à 2 % par mélange vortex pendant >10 s.
- Dissoudre la trypsine lyophilisée de grade MS (Table des matériaux) directement dans la solution réactionnelle (30 mM NH4HCO3 contenant 70 % d’acétonitrile). Ajouter 100 μL de la solution réactionnelle contenant 1 μg de trypsine (Table des matériaux) (30 mM NH4, HCO3 contenant 70 % d’acétonitrile) et incuber à 37 °C pendant la nuit.
- Transvasez la solution réactionnelle contenant les digestions tryptiques dans un tube à essai propre de 1,5 mL à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 100 μL de solution de lavage (70 % d’acétonitrile/1 % d’acide trifluoroacétique) dans la membrane et l’incuber à 60 °C pendant 2 h. Recueillir la solution de lavage et la mélanger avec la solution réactionnelle. Ajoutez encore 100 μL de solution de lavage à la membrane et sonicez-la pendant 10 min. Récupérez ensuite la solution de lavage et mélangez-la avec la solution réactionnelle.
- Couvrez le tube à essai avec un morceau de film de laboratoire et faites quelques petits trous avec une aiguille. Séchez la solution à l’aide d’un concentrateur sous vide.
- Dissoudre le résidu dans 10 μL d’acide formique à 0,2 %. Après centrifugation (12 000 × g, 3 min à température ambiante), transvaser le surnageant dans un tube d’échantillon.
note: Les lavages sont les étapes critiques de cette section. Au cours de la digestion des protéines sur membrane, le lavage des membranes contenant les protéines immobilisées après réduction et alkylation avec de l’eau distillée, suivi de 2 % d’acétonitrile, pendant plus de 10 secondes chacune, est essentiel pour l’élimination des réactifs.
