$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Configuration de l’hydratation et du dosage des biocapteurs
- Allumez la machine BLItz.
- Assurez-vous que la machine est connectée à l’ordinateur via un port de sortie de données USB à l’arrière de la machine.
- Sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel associé (par exemple, BLItz Pro) et cliquez sur Cinétique avancée sur le côté gauche de l’écran.
- Sur le logiciel, tapez toutes les informations appropriées sur l’expérience (y compris le nom de l’expérience, la description, l’ID de l’échantillon et la concentration en protéines) sous chaque en-tête respectif.
- Cliquez sur Type de biocapteur et choisissez Ni-NTA dans le menu déroulant.
- Sous l’en-tête Paramètres d’exécution, vérifiez que le Shaker est défini sur Activer.
- Sous l’en-tête Liste des types d’étapes, vérifiez que 5 éléments sont répertoriés : Base de référence initiale, Chargement, Base de référence, Association et Dissociation.
note: La durée de chaque étape peut être modifiée par défaut si nécessaire. Pour des résultats optimaux, utilisez un minimum de 30 s pour la ligne de base initiale et la ligne de base ; et 120 s pour l’association et la dissociation. La durée de l’étape de chargement (allant de 120 à 240 s) dépendra de la concentration du ligand et de l’affinité de l’étiquette d’épitope His, sur le ligand et le biocapteur Ni-NTA.
- Retirez le biocapteur Ni-NTA hydraté du tube PCR et fixez-le sur le support du biocapteur sur la machine en faisant glisser la partie large du biocapteur sur le support.
note: Ne laissez pas le biocapteur se dessécher pendant l’expérience.
- Placez un tube de microcentrifugation noir de 0,5 ml dans le support de tube de la machine et pipetez 400 μL du tampon BLI dans celui-ci.
- Vérifiez que le curseur de la machine est positionné de telle sorte que le support de tube soit situé devant la flèche noire de la machine.
- Fermez le couvercle de la machine de manière à ce que l’extrémité du biocapteur soit immergée dans le tampon du tube de microcentrifugation.
- Cliquez sur Suivant sur le logiciel pour commencer à enregistrer la référence initiale.
2. Chargement du ligand sur le biocapteur
- Une fois l’enregistrement terminé à l’étape de référence initiale, ouvrez le capot de l’appareil.
- Déplacez le curseur vers la droite de sorte que le support de goutte (au lieu du support de tube) soit situé devant la flèche noire.
- Pipeter 4 μL d’un ligand dialysé marqué His-tag sur le support de goutte et fermer le couvercle de la machine.
REMARQUE : La concentration optimale du ligand à utiliser peut varier pour chaque protéine. Une concentration comprise entre 1,0 et 2,0 mg/mL est généralement suffisante pour saturer le NTA à l’extrémité du biocapteur en 240 s.
- Sur le logiciel, cliquez sur Suivant pour commencer le chargement.
3. Lavage du ligand supplémentaire
- Une fois l’enregistrement terminé à l’étape de chargement, ouvrez le capot de la machine.
- Déplacez le curseur vers la gauche de sorte que le support de tube soit à nouveau situé devant la flèche noire.
- Fermez le couvercle de la machine et assurez-vous que l’embout du biocapteur est immergé dans le tampon BLI du tube dans le support de tube.
- Cliquez à nouveau sur Suivant dans le logiciel pour commencer à enregistrer la ligne de base.
4. Association de l’analyte au ligand
- Une fois l’enregistrement de l’étape Ligne de base terminé, ouvrez le capot de l’appareil.
- Retirez le support de goutte et nettoyez-le en pipetant toute protéine et en le rinçant avec de l’eau doublement désionisée (ddH2O) pour un total de 5 fois.
- Utilisez une lingette pour mouchoir pour nettoyer la surface du porte-goutte après le lavage.
- Replacez le support de chute sur la machine.
- Déplacez le curseur de la machine vers la droite de sorte que le support de goutte soit à nouveau situé devant la flèche noire.
- Pipeter 4 μL d’un analyte dialysé sur le support de goutte et fermer le couvercle de la machine.
- Sur le logiciel, cliquez sur Suivant pour commencer l’association.
5. Dissociation de l’analyte du ligand
- Une fois l’enregistrement terminé, ouvrez le capot de la machine.
- Déplacez le curseur de la machine vers la droite de sorte que le support de tube soit à nouveau situé devant la flèche noire.
- Sur le logiciel, cliquez sur Suivant pour commencer la dissociation.
- Une fois l’enregistrement de l’étape de dissociation terminé, ouvrez le capot de la machine.
- Retirez le support de chute et le support de tube.
- Rincez soigneusement les deux avec de la ddH2O pour éliminer toute protéine.
- Retirez le biocapteur et jetez-le en toute sécurité.