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1. Préparation de l’échantillon : Essai de mélange cellule-cellule
REMARQUE : Le protocole suivant décrit la procédure de mélange pour les cellules adhérentes. Il peut être modifié pour des cellules cultivées en suspension.
- Ensemencez un nombre approprié de cellules sur une plaque à 6 puits, par exemple 800 000 cellules HEK 293T (comptées avec une chambre de comptage Neubauer), un jour avant la transfection. Le nombre peut être modifié en fonction du temps entre l’ensemencement et la transfection et ajusté pour d’autres types de cellules. Pour effectuer une expérience de base (c’est-à-dire des protéines d’intérêt et un contrôle négatif), préparez au moins 4 puits. Cellules de culture à 37 °C, 5 % de CO2 dans le milieu DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco, complété par du sérum fœtal bovin (10 %) et de la L-glutamine (1 %).
- Transfectez les cellules selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Pour réaliser une expérience de base, transfectez, dans des puits séparés, les plasmides de la protéine d'intérêt fusionnés à une protéine fluorescente « verte » (par exemple, protéine fluorescente verte améliorée monomère (mEGFP) ou protéine fluorescente jaune (mEYFP)) ou « rouge » (par exemple, mCherry ou mCardinal)
note: Dans ce protocole, nous nous concentrons sur APLP1-mEYFP et APLP1-mCardinal, et le contrôle négatif correspondant, par exemple, myristoylé-palmitoylé-mEYFP (myr-palm-mEYFP) et -mCardinal (myr-palm-mCardinal). En général, 200 ng à 1 μg d’ADN plasmidique sont suffisants. Une efficacité de transfection élevée augmente les chances de trouver des cellules « rouges » et « vertes » en contact. Modifiez la quantité de plasmide et de réactif de transfection pour optimiser l’efficacité de la transfection. critique: La confluence cellulaire doit être d’environ 70 % lors de la transfection des cellules. Si les cellules sont trop confluentes, l’efficacité de la transfection diminuera. Si les cellules ne sont pas assez confluentes, la transfection et le mélange peuvent induire un stress et empêcher de nombreuses cellules de se fixer correctement après le mélange.
- Effectuer le mélange cellulaire ~4 ± 2 h après la transfection.
- Retirer le milieu de croissance et bien laver chaque puits avec 1 mL de PBS complété par Mg2+ et Ca2+. Ensuite, retirez le PBS. (Critique) Déposez le PBS sur le bord du puits pour éviter le détachement des cellules pendant le lavage.
- Ajouter ~50 μL de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de trypsine goutte à goutte dans chaque puits pour faciliter le détachement des cellules. Incuber à 37 °C pendant 2 min. Ensuite, secouez lentement la plaque à 6 puits latéralement pour détacher les cellules.
note: Des temps d’incubation prolongés peuvent être nécessaires pour certains types de cellules.
- Ajoutez 950 μL de milieu de croissance dans chaque puits et remettez les cellules en suspension en les pipetant plusieurs fois de haut en bas, détachant ainsi toutes les cellules du fond du puits. (Critique) Assurez-vous que les cellules sont correctement remises en suspension et détachées les unes des autres en vérifiant visuellement l’absence de gros agrégats de cellules après la remise en suspension. Sinon, de nombreux contacts 'rouge'-'rouge' ou 'vert'-'vert' seront obtenus après le mélange.
- Transférez la solution cellulaire d'un puits (protéine d'intérêt ou témoin négatif) dans le puits correspondant, c'est-à-dire des cellules « rouges » (par exemple, APLP1-mCardinal transfectées) vers des cellules « vertes » (par exemple, APLP1-mEYFP transfectées). Mélangez en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas. Ensuite, ensemencez les cellules mixtes dans des boîtes à fond de verre de 35 mm (1 mL de solution cellulaire mixte par boîte, plus 1 mL de milieu de croissance) et cultivez les cellules ensemencées pour une autre journée à 37 °C, 5 % de CO2.
2. Préparation des échantillons : contrôle positif pour les expériences de corrélation croisée et construction d’homo-dimères pour l’analyse de la luminosité
- Grainez 600 000 cellules HEK 293T, comptées avec une chambre de comptage de cellules, sur des plats à fond de verre de 35 mm un jour avant la transfection. Cultivez les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 dans un milieu DMEM complet (voir étape 1.1) pendant un autre jour.
- Transfectez les cellules avec ~250 ng d’ADN plasmidique selon les instructions du fabricant. Pour le contrôle positif par corrélation croisée, utilisez un plasmide codant pour un hétéro-dimère de protéine fluorescente ancré dans une membrane, par exemple, myr-palm-mCherry-mEGFP ou myr-palm-mCardinal-mEYFP correspondant aux PF de la protéine d’intérêt. Pour l’étalonnage de la luminosité, utilisez des plasmides codant à la fois un monomère FP ancré à la membrane et un homo-dimère correspondant aux FP fusionnés à la protéine d’intérêt, par exemple, myr-palm-mEYFP et myr-palm-mEYFP-mEYFP pour calibrer l’analyse de luminosité de APLP1-mEYFP.
- Cultiver des cellules à 37 °C, 5 % de CO2 dans un milieu DMEM complet (voir étape 1.1) pour un autre jour.
3. Microscopie confocale à balayage laser : configuration et étalonnage du volume focal
REMARQUE : Le protocole suivant est écrit pour les expériences réalisées avec mEGFP/mEYFP et mCherry/mCardinal sur le microscope confocal à balayage laser utilisé dans cette étude. La configuration optique, les paramètres logiciels (lignes laser, miroirs dichroïques, filtres) et le choix des colorants d’étalonnage peuvent être modifiés pour d’autres PF et configurations de microscope.
- Allumez le microscope et les lasers au moins une heure avant l’expérience pour assurer la stabilité du laser et l’équilibre de la température.
- Préparez 100 à 200 μL de solutions de colorant fluorescent hydrosolubles appropriées (voir le tableau des matériaux pour des exemples) dans de l’eau ou du PBS pour calibrer le volume focal, avec des concentrations comprises entre 10 et 50 nM.
- Placez les solutions de colorant sur un plat à fond de verre propre de 35 mm #1.5, c’est-à-dire ayant une épaisseur de 0,16-0,19 mm.
note: Idéalement, utilisez des plats avec un verre de protection haute performance ayant une faible tolérance d’épaisseur, par exemple 0,170 ± 0,005 mm, permettant une correction optimale de l’anneau du collier (étape 3.6). Il est important d’utiliser le même type de plat que celui utilisé plus tard pour les expériences suivantes.
- Placez le plat contenant la solution de colorant directement sur l’objectif (de préférence, immersion dans l’eau, avec NA 1,2) pour assurer la mise au point dans la solution. Vous pouvez également placer la parabole sur le porte-échantillon et faire la mise au point sur l’échantillon (par exemple, à 10-20 μm au-dessus du fond de la parabole).
REMARQUE : Nous ne recommandons pas l’utilisation d’objectifs à huile en raison du faible signal obtenu lors de la mise au point profonde dans des échantillons aqueux.
- Configurez le chemin d’excitation et d’émission, par exemple, choisissez le laser 488 nm, un miroir dichroïque 488/561 nm, une fenêtre de détection 499-552 nm et une taille de sténopé de 1 unité Airy (AU). Assurez-vous que la taille du sténopé est la même que celle qui sera utilisée dans les mesures de corrélation croisée.
- Ajustez la position du sténopé (réglage du sténopé) et l’anneau du collier de l’objectif pour maximiser le taux de comptage. Pour ce faire, tournez l’anneau du collier jusqu’à ce que le taux de comptage maximal soit détecté.
note: La correction de l’anneau du collier tient compte de l’épaisseur spécifique du verre de protection utilisé. Maximiser le taux de comptage, c’est-à-dire collecter autant de photons que possible par molécule, est crucial pour maximiser le rapport signal/bruit (SNR) des mesures.
- Effectuez une série de mesures FCS ponctuelles (par exemple, 6 mesures à différents endroits, chacune consistant en 15 répétitions de 10 s, c’est-à-dire un temps total de 2,5 minutes, échantillonné avec un temps de séjour de 1 μs ou moins) à la même puissance laser que celle utilisée pour les mesures de corrélation croisée (généralement ~1 %, c’est-à-dire ~1-2 μW).
- Ajuster un modèle de diffusion tridimensionnel incluant une contribution triplée (équation 1) aux données.
![figure-protocol-1]( "figure-protocol-1")
4. Spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence à balayage : acquisition
REMARQUE : Le protocole suivant est écrit pour les expériences réalisées avec mEGFP/mEYFP ('vert') et mCherry/mCardinal ('rouge') sur le microscope confocal à balayage laser utilisé dans cette étude. La configuration optique et les paramètres logiciels (lignes laser, miroirs dichroïques, filtres) peuvent être différents pour d’autres FP ou configurations de microscope.
- Configurez le chemin optique, par exemple, une excitation de 488 nm et 561 nm et un miroir dichroïque de 488/561 nm, un sténopé sur 1 UA pour une excitation de 488 nm. Pour éviter la diaphonie spectrale, sélectionnez deux pistes distinctes pour exciter et détecter mEGFP/mEYFP (excitation 488 nm, canal vert) et mCherry/mCardinal (excitation 561 nm, canal rouge) séquentiellement et sélectionnez changer de piste chaque ligne. Pour la détection, utilisez des filtres appropriés pour les deux canaux, par exemple, 499-552 nm dans le canal vert et 570-695 nm dans le canal rouge.
- S’il n’est pas possible d’alterner l’excitation, utiliser les réglages de filtre appropriés pour le canal rouge afin de minimiser la diaphonie spectrale (c’est-à-dire détecter la fluorescence mCherry/mCardinal non inférieure à 600 nm). Cela peut réduire la quantité de photons détectés dans le canal rouge et donc réduire le SNR.
- Placez le plat contenant les cellules mélangées sur le porte-échantillon. Attendez au moins 10 minutes pour assurer l’équilibre de la température et réduire la dérive de la mise au point.
- Concentrez-vous sur les cellules à l’aide de la lumière de transmission dans le menu Localiser.
- Recherchez une paire de cellules « rouges » et une cellule « verte » en contact l'une avec l'autre. Pour la corrélation croisée positive ou le contrôle de la luminosité des homo-dimères (voir section 2), recherchez une cellule isolée émettant de la fluorescence dans les deux canaux ou le signal homo-dimère respectif au niveau du PM.
REMARQUE : (Critique) Minimisez l’exposition de l’échantillon lors de la recherche de cellules pour éviter le pré-blanchiment, ce qui peut réduire la corrélation croisée. Par conséquent, scannez à la vitesse de balayage la plus rapide et avec de faibles puissances laser. Pour éviter la saturation du détecteur lors de l’imagerie de cellules exprimant fortement, effectuez une recherche en mode intégration. Cependant, pour minimiser l’exposition, il est possible de balayer à des puissances laser plus faibles en mode comptage de photons.
- Sélectionnez une trajectoire de balayage perpendiculaire au contact cellule-cellule (ou à la MP d’une seule cellule pour la corrélation croisée positive ou le contrôle de la luminosité des homo-dimères) à l’aide du bouton Recadrer, comme illustré dans les figures 1B et 2A.
note: Certains microscopes plus anciens ne permettent pas de directions de balayage arbitraires. Dans ce cas, les contacts cellule-cellule avec une orientation perpendiculaire à la direction de balayage doivent être localisés.
- Zoomez pour atteindre une taille de pixel de 50 à 200 nm et sélectionnez Ligne en mode de balayage. Réglez la taille de l’image sur 128 × 1 pixels.
note: La taille typique des pixels est de 160 nm, ce qui correspond à une longueur de balayage d’environ 20 μm.
- Réglez la vitesse de balayage sur la valeur maximale autorisée, par exemple, 472,73 μs par ligne.
note: Pour un schéma d’excitation alternatif, cela correspond à un temps de balayage de 954,45 μs, soit ~1000 balayages/s sur la configuration utilisée. La vitesse de balayage peut être ajustée en fonction du coefficient de diffusion de la protéine d’intérêt. Pour les protéines ancrées membranaires, les temps de diffusion typiques sont d’environ 10 à 20 ms. Le temps de balayage doit être au moins dix fois plus court que les temps de diffusion. Des vitesses de balayage plus faibles peuvent induire un photoblanchiment plus fort et nécessiter des puissances d’éclairage plus faibles. Alternativement, on peut imposer une pause, par exemple 5 ms, entre chaque balayage pour les complexes à diffusion très lente à l’aide de l’intervalle dans le sous-menu Séries chronologiques.
- Choisissez les puissances laser appropriées, par exemple, ~1-2 μW pour une excitation de 488 nm et ~5-10 μW pour une excitation de 561 nm.
note: Des puissances laser plus élevées améliorent le SNR, mais augmentent le photoblanchiment. Par conséquent, les puissances laser doivent être choisies de manière à ce que le photoblanchiment soit inférieur à 50 % du taux de comptage initial.
- Réglez les cycles sur 100 000-500 000.
note: Le nombre de balayages, c’est-à-dire la durée de la mesure, peut varier : des temps de mesure plus longs amélioreront le SNR et peuvent être plus appropriés pour les molécules à diffusion lente, cependant, le mouvement des cellules et le photoblanchiment limitent le temps de mesure maximal. Les données présentées ici ont été acquises de manière routinière pendant ~3 à 6 minutes, c’est-à-dire 200 000 à 400 000 balayages de lignes.
- Réglez les détecteurs sur le mode de comptage de photons. Appuyez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition. Répétez les étapes 4.5 à 4.11 pour mesurer une autre cellule.
note: Il est recommandé de mesurer 10 à 15 cellules par échantillon à différents niveaux d’expression. (Critique) Éviter la saturation du détecteur à des niveaux d’expression élevés. Le taux de comptage maximal ne doit pas dépasser ~1 MHz.
- Si une analyse de luminosité est effectuée pour déterminer des états oligomères, effectuer des mesures d’étalonnage de la luminosité des homo-dimères conformément aux étapes modifiées 4.1-4.11 : Mesurer chaque homo-dimère de protéine fluorescente séparément (dans des cellules isolées, préparées à l’aide de la section 2 du protocole) et effectuer des mesures uniquement dans un canal spectral.
