Dosage de l’immunoprécipitation pour étudier les interactions entre les récepteurs enzymatiques dans les cellules transfectées

Résumé

Source : Strazza, M., et al. Essai de co-immunoprécipitation pour l’étude des interactions fonctionnelles entre les récepteurs et les enzymes. J. Vis. Exp. (2018).

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique permettant d’effectuer la co-immunoprécipitation de protéines-1 de type sauvage et mutées marquées à la GFP à l’aide de billes enrobées d’anticorps anti-GFP. Les protéines-1-GFP liées aux billes sont incubées avec les protéines SHP2 qui interagissent avec-1, ce qui permet d’identifier des motifs structurels spécifiques dans-1 qui jouent un rôle essentiel dans l’interaction SHP2.

Protocole

1. Immunoprécipitation

REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées sur de la glace ou à 4 °C.

1. Compléter le tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl à pH 7,2, 250 mM de NaCl, 0,1 % de NP-40, 2 mM d’EDTA, 10 % de glycérol) avec des inhibiteurs de protéase (dissoudre 1 comprimé dans 10 mL de tampon de lyse) et avec 1 mM d’orthovanadate de sodium. Ajoutez 500 μL de tampon de lyse glacé dans les cellules et retirez et collectez immédiatement les cellules des plaques à l’aide d’un grattoir à cellules.
   note: Il est important d’ajouter l’orthovanadate de sodium uniquement au tampon de lyse qui sera utilisé pour les plaques transfectées-1-GFP, car les plaques transfectées SHP2 et les plaques de contrôle non transfectées doivent conserver l’activité de la phosphatase.
2. Transférez les lysats dans des tubes froids de 1,5 mL et faites-les pivoter à 0,005 x g, 4 °C pendant 30 min.
3. Pour recueillir les noyaux surnageants (PNS) des lysats, faites tourner les lysats pendant 10 min à 10 000 x g à 4 °C et transférez les surnageants dans de nouveaux tubes. Jetez la pastille. Conservez les surnageants de la deuxième série de six plaques (figure 1) sur de la glace pour une analyse ultérieure du lysat de cellules entières.
4. Préparation des billes anti-GFP pour l’immunoprécipitation de-1-GFP à partir des lysats transfectés-1-GFP de la première série (quatre plaques) (Figure 1).
   1. Pour éviter le dépôt des billes, secouez doucement le flacon avec les billes avant de l’ouvrir. Retirez 40 μL de billes anti-GFP de la boue pour chaque condition.
   2. Essorer à 500 x g pendant 3 min à 4 °C et retirer le surnageant pour laver les billes.
      note: Il est important de minimiser le contact entre les pointes en plastique de la pipette et les billes d’agarose pour éviter les pertes. Il est recommandé de couper le bord d’une pointe de 200 μL avant de transférer les billes dans un autre tube.
   3. Remettre les billes en suspension dans 80 μL de tampon de lyse (par échantillon).
5. Ajoutez les billes lavées directement dans le lysat cellulaire (PNS) à partir des cellules exprimant-1-GFP du premier ensemble (quatre plaques) (étape 1.3). Tourner à 0,005 x g pendant 30 min à 4 °C pour immunoprécipiter les protéines marquées GFP.
6. Laver les billes avec 1 mL de tampon de lyse à froid (sans orthovanadate) 3 fois. Centrifuger le tube à 2 500 x g pour 10 s.
   note: Lorsque vous ajoutez le tampon de lyse aux billes, ajoutez-le directement sur les billes sans les toucher avec les pointes. Il n’est pas nécessaire de pipeter de haut en bas pendant les lavages.
7. De même, divisez le lysat de la SHP2 active de la première série (une plaque ; étape 1.3) et ajoutez-le à trois tubes de billes lavées contenant du-1-GFP (le WT-1-GFP et les deux mutations différentes déficientes en phospho, Y223F et Y248F). Ajoutez un tiers du volume du lysat des cellules non transfectées au deuxième tube des billes WT-1-GFP. Jetez les deux tiers restants.
8. Incuber les billes pendant 4 h à 4 °C avec une rotation douce (0,005 x g).
9. Lavez les billes deux fois avec 1 mL de tampon de lyse froide (sans pervanadate ni orthovanadate), comme indiqué à l’étape 1.6.
10. Ajouter 80 μL de tampon de lyse (sans pervanadate ni orthovanadate) par échantillon, en veillant à ce que le volume total dans chaque tube soit de 100 μL (20 μL de billes et 80 μL de tampon de lyse). Mélanger délicatement et transférer 50 μL de chaque tube dans deux tubes frais de 1,5 mL.
    note: Après cette étape, il y aura deux tubes remplis d’un mélange contenant des billes et un tampon de lyse. L’un des tubes sera utilisé pour tester le SHP2 co-immunoprécipité par western blot.

2. Analyse par transfert Western SHP2

1. Faites tourner les perles et retirez le surnageant.
2. Ajouter 20 μL de tampon 2x Laemmli (voir tableau des matériaux) aux billes et faire bouillir à 95 °C pendant 5 min.
3. Mesurer la concentration en protéines des témoins d’entrée (deuxième série) à l’aide d’un kit BCA (voir tableau des matériaux). Transférez 30 μL de l’échantillon le plus dilué dans un nouveau tube. Diluez le reste des commandes d’entrée avec un tampon de lyse à la même concentration que l’échantillon le plus dilué et transférez 30 μL de chacune d’elles dans un nouveau tube.
   note: Après cette étape, il y aura 4 tubes de 30 μL chacun, à des concentrations protéiques similaires, représentant les lysats de contrôle d’entrée.
4. Ajouter des volumes égaux de 2 tampons Laemmli aux lysats et les faire bouillir à 95 °C pendant 5 min. Faire tourner les billes et charger le surnageant dans un gel à base de 4 à 20 % de SDS-PAGE à base de Tris (voir le tableau des matériaux) pour l’analyse par transfert Western. De plus, chargez 50 μL de chaque échantillon de la deuxième série.
5. Poursuivre l’analyse par transfert de Western.

Résultats

Figure 1 : Conditions expérimentales et stratégie. GFP--1 WT (type sauvage), GFP--1 Y223F (mutant ITIM) ou GFP--1 Y248F (mutant ITSM) ont été exprimés dans les cellules T HEK 293T qui ont ensuite été traitées avec du pervanadate. Les protéines GFP--1 phosphorylées recueillies par immunoprécipitation GFP ont été mélangées à des lysats de cellules surexprimant SHP2, et les niveaux et l’activit...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Membranes de nitrocellulose	General Electric	10600004
Microcentrifugeuse	Eppendorf	Référence 5424-R	1,5 mL
BCA	pêcheur	Référence 23225	Dosage de l’acide bi-cinchoninique
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti-GFP-agarose	MBL	Réf. D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-actine	Santa Cruz	SC-1616
Cellules HEK-293	ATCC	CRL-1573
L’orthovanadate	sigma	S6508
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	11836170001	Sans EDTA
Tris-Glycine Tampon d’échantillon SDS (2x)	Invitrogen	Référence LC2676	Tampon Laemmli modifié
4-20 % Mini Gels de Tris-Glycine	Invitrogen	XP04205BOX	15 puits
Trypsine-EDTA (0,25 %) Rouge de phénol	Gibco	25200114
NaCl	sigma	Réf. S7653	chlorure de sodium