Méthode ELISA d’analyse des interactions entre les protéines d’appât et de proie

Abstract

Source : Singh, B. et al., Assays for Study the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit une technique basée sur ELISA qui détecte les interactions protéine-protéine entre deux protéines en mesurant la liaison de la deuxième protéine à la première protéine immobilisée. La deuxième protéine liée est détectée à l’aide d’anticorps spécifiques marqués avec une enzyme, comme la peroxydase de raifort.

Protocol

1. Analyse ELISA de l’interaction entre PH recombinant et Vn

REMARQUE : Les contrôles doivent être inclus pour exclure les liaisons non spécifiques. Le facteur humain H (FH) ou la protéine de liaison C4b (C4BP) sont utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement.

1. Diluer chacune des protéines humaines (Vn, FH et C4BP) séparément à 50 nM dans du Tris-HCl, pH 9,0 (tampon d’enrobage). Versez 100 μL de solution protéique dans chaque puits d’une plaque de microtitration Polysorp. Fermez les plaques avec le couvercle et conservez-les à 4 °C pendant la nuit (16 h) pour faciliter l’immobilisation des protéines sur les puits de microtitration des plaques.
2. Jetez la solution de la plaque de microtitration en l’inclinant à l’envers au-dessus de l’évier et lavez les puits trois fois avec 300 μL de PBS/puits. Bloquer les puits enrobés pendant 1 h à RT avec du PBS contenant 2,5 % (p/v) d’ABR (PBS-BSA).
3. Après avoir retiré la solution de blocage, laver les puits trois fois avec 300 μL de PBS contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 (PBST) par puits. Ajouter 100 μL de PH recombinant marqué à His 50 nM dans chaque puits d’échantillon et incuber pendant 1 h à RT. Dans les puits témoins, ajouter seulement 100 μL de PBS-BSA.
   note: Le gène lph codant pour PH de Hif a été amplifié par PCR et cloné dans le vecteur d’expression pET26b qui ajoute une balise 6× His à l’extrémité C-terminale de la protéine exprimée. Le vecteur recombinant a été transformé en E. coli BL21(DE3) pour l’expression. La résine Ni-NTA a été utilisée pour purifier la protéine recombinante.
4. Jetez la solution protéique et retirez les protéines non liées en lavant les puits trois fois avec 300 μL de PBST par puits. Ajouter 100 μL de PBS-BSA contenant des pAbs anti-His conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution 1:10 000) et incuber pendant 1 h à RT.
5. Préparer 20 mM de solution A en dissolvant la tétraméthylbenzidine dans une solution de 5 % d’acétone et de 45 % de méthanol. Pour préparer la solution B, dissoudre 19,2 g d’acide citrique dans 1 000 mL de_H2O, ajuster le pH à 4,25 en ajoutant du KOH, puis ajouter 230 μL de 30 % de_H2O2. Stockez les deux solutions dans l’obscurité chez RT. Juste avant l’utilisation, mélanger 500 μL de solution B avec 9,5 mL de solution A pour préparer le réactif de détection ELISA.
6. Lavez les puits trois fois avec 300 μL de PBST par puits et détectez les complexes antigène-anticorps en ajoutant 100 μL de réactif de détection ELISA dans chaque puits.
7. Ajouter 50 μL de 1 M H₂SO₄/puits pour arrêter la réaction. Mesurer la densité optique des puits à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capteurs AR2G	Pall Life Science	Référence 18-5095	Capteur à protéine immobilisée par couplage d’acides aminés
acétone	VWR	Référence 97064-786	Note d’analyse
Albumines sériques bovines (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Convient pour la culture cellulaire
C4BP (protéine de liaison C4b)	Technologie du complément, Inc.	A109	Acheté sous forme liquide congelée
acide citrique	Sigma-Aldrich	Référence 251275-500G	Grade de l’American Chemical Society (ACS)
Anticorps anti-His conjugués à la HRP	Abcam	AB1269	Polyclonal
C4BP	Technologie du complément, Inc.	A109	Solution congelée
Colonne de résine d’affinité à l’histidine (HisTrap HP)	GE Health Care Sciences de la vie	Référence : 17-5247-01	Colonnes préemballées avec du Ni Sepharose
Son étiquetage PH			Exprimé de manière recombinante et purifié dans notre laboratoire
Méthano	VWR	BDH1135-1LP	Note d’analyse
Plasmide contenant un His-tag C-terminal 6x sur le squelette (pET26(b))	Novagen	Référence 69862-3	Vecteur d’ADN
Plaques de microtitrage Polysorb	Sigma-Aldrich	Référence M9410	Pour ELISA
Tétraméthylbenzidine	Sigma-Aldrich	Référence 860336-100MG	Grade ELISA
Vitronectine (Vn) à partir de plasma humain	Sigma-Aldrich	Réf. V8379-50UG	Qualité de culture cellulaire