Dosage par biocapteur conductimétrique basé sur la β-lactamase pour les interactions protéine-protéine

Résumé

Source : Vandevenne, M., et al. L’utilisation d’un biocapteur conductimétrique basé sur la β-lactamase pour détecter les interactions biomoléculaires. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente un test de biocapteur conductimétrique pour étudier l’interaction d’un anticorps avec un antigène cible immobilisé sur une puce de transducteur. Le biocapteur est conçu pour avoir une protéine chimérique bifonctionnelle – une enzyme β-lactamase avec un site catalytique fonctionnel fusionné à un nanocorps pour se lier à l’antigène cible immobilisé. Lors de la liaison, l’hydrolyse catalytique d’un substrat antibiotique par l’enzyme β-lactamase génère un signal électrique, confirmant l’interaction antigène-anticorps.

Protocole

1. Préparation d’échantillons de protéines

1. Produire et purifier la protéine hybride BlaP-cAb-Lys3 comme indiqué dans notre étude précédente. Stocker la protéine dans un tampon phosphate de 50 mM pH 7,4 avec la composition suivante : 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,24 g de KH₂PO₄ dissous dans 800 mL d’eau distillée Fixer le pH de la solution à 7,4 avant d’ajuster le volume final de la solution à 1 L. Filtrer stériliser la solution protéique.
2. Préparez une solution mère de lysozyme de blanc d’œuf de poule (HEWL). Dissoudre 100 mg (40 000 unités/mg) de HEWL acheté dans le commerce dans 10 mL de solution saline tampon phosphate (PBS, voir l’étape 2.1.1). Stériliser la solution protéique par filtration à l’aide de filtres avec une coupure de 0,22 μm.

2. Dosages de biocapteurs

1. Préparation de la solution et du tampon
   1. Préparez 50 mM de PBS en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,24 g de KH₂PO₄ dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster à un pH de 7,4 avec 1 N HCl ou 1 N NaOH avant d’ajuster le volume de la solution à 1 L. Filtrer et stériliser et conserver à 4 °C.
   2. Préparez une solution de saturation/blocage en dissolvant 3 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme décrit ci-dessus (voir l’étape 2.1.1). Filtrer, stériliser et conserver à 4 °C.
   3. Préparez une solution liante en dissolvant 1 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme décrit ci-dessus (voir étape 2.1.1). Filtrer, stériliser et conserver à 4 °C.
   4. Préparez une solution de lavage (0,1 % de Tween - PBS) en ajoutant 100 μL de Tween 20 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme décrit ci-dessus (voir l’étape 2.1.1). Conserver à 4 °C.
   5. Préparez une solution de préparation d’électrode (1 % de Triton X-100 - PBS) en ajoutant 1 mL de Triton X-100 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme décrit ci-dessus (voir l’étape 2.1.1). Conserver à 4 °C.
   6. Préparez une solution de régénération d’électrode (3,5 M KCl) en dissolvant 26 g de KCl dans de l’eau distillée jusqu’à un volume final de 100 mL. Filtre stérilisé et conservé à 4 °C.
   7. Préparez une solution de NaCl de 5 mM en dissolvant 0,29 g de NaCl dans de l’eau distillée jusqu’à ce qu’il atteigne un volume final de 1 L. Filtrez, stérilisez et conservez à 4 °C. Ensuite, préparez une solution de détection (4 mM de benzylpénicilline) en dissolvant 26,7 mg de benzylpénicilline dans 20 mL de solution de 5 mM de NaCl. Filtrer, stériliser et conserver à -20 °C.
2. Préparation et régénération des capteurs
   note: Les puces de capteur recouvertes de polyaniline ont été développées et aimablement fournies par le Dr P. Bogaerts, le Dr S. Yunus et le Prof. Y. Glupczynski (Université catholique de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La description du capteur ainsi que les protocoles d’électropolymérisation de la polyaniline utilisés pour synthétiser ces capteurs sont détaillés dans leurs travaux précédents. En bref, ce système utilise des capteurs réutilisables de huit puces individuelles qui ont été fabriquées par des techniques classiques de cartes de circuits imprimés (PCB). Les puces individuelles sont composées de trois points ronds d’électrodes. Celle du haut est l’électrode de travail sur laquelle la polyaniline a été électrosynthétisée. Celle du milieu est l’électrode de référence et l’électrode inférieure constitue la contre-électrode. Les électrodes de référence et les contre-électrodes sont fonctionnalisées à l’aide d’un amalgame solide Ag/AgCl sur la couche de carbone.
   1. Effectuez 3 lavages des électrodes en trempant les pointes dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 μL/puits de solution de préparation d’électrode (1 % Triton X-100 - PBS, voir étape 2.1.5.). Effectuez chaque lavage pendant 2 minutes en mélangeant doucement à température ambiante.
   2. Rincez les électrodes en trempant les pointes dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 μL/puits d’eau distillée pendant 2 min en mélangeant doucement à température ambiante.
   3. Régénérer les électrodes en plongeant les pointes dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 μL/puits de solution de régénération (3,5 M KCl, voir étape 2.1.6) pendant une nuit à 4 °C ou 1 h à température ambiante.
   4. Effectuez 3 lavages des électrodes en trempant les pointes dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 μL/puits de solution saline tampon phosphate (voir étape 2.1.1.). Effectuez chaque lavage pendant 2 minutes en mélangeant doucement à température ambiante.
3. Dosage de liaison réalisé sur le capteur
   1. Appliquez HEWL sur la surface PANI (polyaniline) de l’électrode en déposant une goutte de 15 μL de HEWL à 40 μg/mL préparée dans du PBS sur la surface de l’électrode. Incuber une nuit à 4 °C ou 1 heure à température ambiante.
   2. Effectuez trois lavages des électrodes avec une solution saline tampon phosphate (voir étape 2.1.1) en trempant les parties électrodes des puces du capteur dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 μL/puits de solution saline tampon phosphate. Effectuez chaque lavage pendant 2 minutes en mélangeant doucement à température ambiante.
   3. Saturez les électrodes en ajoutant une goutte de 50 μL de la solution de blocage (voir étape 2.1.2) sur la surface de l’électrode. Incuber 1 h à température ambiante. Ensuite, lavez trois fois comme décrit à l’étape précédente (voir étape 2.3.2).
   4. Diluer la solution de BlaP-cAb-Lys3 à 20 μg/mL dans une solution de liaison (voir étape 2.1.3) et appliquer une goutte de 15 μL de cette solution diluée sur les électrodes. Incuber 10 min à température ambiante. Après la réaction antigène-nanocorps, laver trois fois comme décrit à l’étape précédente en utilisant la solution de lavage (voir étape 2.1.4). Rincez ensuite une fois l’électrode avec du PBS (voir étape 2.1.1).
   5. Pour la détection, branchez la puce du capteur via la partie cuivre dans un multimètre numérique. Ensuite, amorcez la réponse du capteur en appliquant une goutte de 50 μL de solution de détection (voir l’étape 2.1.7) sur les électrodes positives et en appliquant une goutte de 50 μL de solution de NaCl 5 mM sur les électrodes négatives (voir l’étape 2.1.7). Incuber 30 min à température ambiante. Surveiller la conductance à l’aide d’un multimètre numérique.
      note: Le multimètre a été fourni par le Dr P. Bogaerts, le Dr S. Yunus et le Prof. Y. Glupczynski (Université catholique de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Ce potentiostat est contrôlé par ordinateur via un port USB et analyse simultanément les huit puces différentes du capteur. Le logiciel créé par Yunus et ses collègues crée un graphique en temps réel qui représente les mesures de la différence de conductance entre les électrodes de référence et d’échantillon en fonction du temps.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	Réf. S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
Edta	Sigma-Aldrich	E9884
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M6250
alanine	Sigma-Aldrich	A7627
HClO4	Fluka	Référence 34288	Solution HClO4 1M, distributeur : Sigma-Aldrich
Hydrolysat de caséine	Sigma-Aldrich	Référence 22090
Benzylpénicilline sodique	Sigma-Aldrich	B0900000
Lysozyme de blanc d’œuf de poule	Roche	10837059001
heptane	Sigma-Aldrich	246654
méthanol	Sigma-Aldrich	322415
Solution d’hydroxyde d’ammonium	Sigma-Aldrich	380539	28 % NH3 en H2O, purifié par double distillation (concentré ?)
Consommables de laboratoire
Plaque à 6 puits	Greiner Bio-One	657165	Plaque CELLSTAR à 6 puits
équipement
Ph-mètre	WTW	1AA110	pH-mètre de laboratoire inoLab pH 7110
Système d’aspiration et de filtration	Nalgene	NALG300-4100	Porte-filtres avec récepteur, distributeur : VWR
Puces de capteur potentiométriques			fabriqué par Yunus et ses collègues (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		discontinué, successeur Autolab PGSTAT302N
Multimètre numérique, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		discontinué, successeur de la base Metrahit