1. Cellules
- Deux jours avant de commencer la procédure, plaquez les cellules à la densité requise pour être confluentes le jour de l’expérience. Plaquez les cellules dans des flacons ou des plaques. Cependant, l’extraction des protéines sera plus facile à partir des plaques. Il convient de préparer au moins 4 plaques de 78 cm2 ou 2 flacons de 150 cm2 par condition et par expérience, pour être sûr que les résultats sont cohérents.
- Dans cette étude, on a mis en boîte des cellules souches humaines G166 dans 4 flacons de 150 cm2, cultivées dans un milieu de cellules souches RHB-A additionnées de 2 % de B27, de 1 % de N2, de 20 ng/mL d’EGF et de b-FGF, comme décrit par Pollard et al. Processus lorsque la confluence a été atteinte. Par exemple, lorsque 5 x 10cellules 6 G166 ont été plaquées dans une fiole de150 cm 2, elles ont été traitées 2 jours après le placage.
2. CPP biotinylés
- Faites tourner les flacons contenant les CPP biotinylées lyophilisées (BCPP) à 8200 x g pendant 30 s, pour éviter qu’une partie de la poudre ne reste sur le couvercle. Incluez un contrôle BCPP pour vous assurer que les interactions trouvées sont spécifiques à la séquence cible. Dans cette étude, le BCPP témoin était la TATbiotine (TAT-B) et le BCPP de traitement était le TAT-Cx43266-283-B. D’autres contrôles pourraient être utilisés, tels que TAT fusionné à des fragments brouillés ou mutés liés à la biotine.
- Dissoudre les BCPP dans le milieu de culture correspondant à la solution mère indiquée par le fabricant ; par exemple, pour obtenir une solution mère de 2 mg/mL de BCPP pour traiter les GSC, ajouter 0,5 mL de milieu de culture de GSC à un flacon contenant 1 mg de BCPP. Vortex et assurez-vous que le peptide est bien dissous.
3. Tubes
REMARQUE : Préparez au moins douze tubes de 1,5 mL par condition requise dans la section
- Marquez les 3 premiers tubes par condition. Ils auront le volume total de lysats cellulaires obtenu à l’étape 6.4.
- Marquez un A dans 3 tubes par condition. Ces tubes auront les premiers surnageants obtenus après lyse et rotation des lysats cellulaires, étape 7.2.
- Marquer un B dans 3 tubes par condition. Ces tubes auront une petite aliquote des premiers surnageants. Ces lysats serviront d’échantillons par transfert Western à l’étape 7.3.
- Marquer un C dans 3 tubes par condition. Ces tubes auront les surnageants obtenus après le pull-down avec NeutrAvidin, étape 7.7.
note: Ceci est important dans le cas où le Western blot n’a montré aucun signal pour les protéines, ce qui signifie que les protéines n’ont pas été tirées vers le bas ou ont été perdues à une étape de la procédure. Si tel était le cas, répétez le processus pour tirer les protéines vers le bas.
4. Traitement cellulaire avec les BCPP
- Aspirez le milieu de culture.
- Remplacer le volume correspondant de milieu frais requis pour incuber les BCPP dans le plus petit volume possible de milieu en fonction des temps d’incubation. Il est très important que, dans tous les cas, le milieu recouvre complètement toute la surface de la plaque/du ballon afin que les cellules ne se dessèchent pas, par exemple, 6 mL par 150cm2 pour une incubation de 30 min.
- Ajoutez le volume de la solution mère de BCPP aux cultures cellulaires pour atteindre la concentration dont l’efficacité a été prouvée. Dans cette étude, il a été prouvé que le TAT-Cx43266-283-B de 50 μM réduit la prolifération des GSC.
- Par conséquent, ajouter 92,8 μL de 2 mg/mL de TAT-Cx43266-283-B (MW = 3723,34 g/mol) par mL de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 50 μM de TAT-Cx43266-283-B. Si le volume à ajouter est différent pour les peptides témoins, complétez avec le milieu de culture jusqu’au même volume final. Par exemple, 49,1 μL DE TAT-B (MW = 1914,31 g/mol) et 43,7 μL de milieu GSC ont été ajoutés par mL de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 50 μM DE TAT-B.
- Placez les cellules dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min pour vous assurer que les interactions entre le BCPP et ses partenaires intracellulaires ont lieu. Si l’interaction prend plus de temps, incubez pendant des périodes plus longues ou ajustez les temps si l’expérience consistait en un cours temporel. De plus, l’interaction d’intérêt peut être favorisée ou empêchée en stimulant différentes voies de signalisation intracellulaires.
5. Tampons et solutions
- Préparer PBS pH 7,4 : 136 mM NaCl ; 2,7 mM KCl ; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1,7 mM KH2PO4.
- Préparez le tampon de lyse des protéines : 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM de NaCl, 1 % d’IGEPAL, Avant l’utilisation, ajoutez ce qui suit : 1/100 (v/v) de cocktail d’inhibiteur de protéase, 1 mM de fluorure de sodium, 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) et 0,1 mM d’orthovanadate de sodium.
- Préparez le tampon Laemmli : (4x : 0,18 M Tris-HCl pH 6,8 ; 5 M glycérol ; 3,7 % SDS (p/v) ; 0,6 M β-mercaptoéthanol ou 9 mM DTT ; 0,04 % (v/v) bleu de bromophénol (BB)).
6. Extraction des protéines
REMARQUE : L’extraction des protéines a été effectuée comme décrit précédemment. Effectuez toute cette section de la procédure à 4 °C.
- Aspirez complètement le milieu de culture.
- Lavez très soigneusement 3 x 10 ml avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée par 150cm2 pour éviter le détachement des cellules.
- Pour obtenir le lysat cellulaire, ajoutez 3 mL de tampon de lyse par 150cm2 et grattez soigneusement la surface à l’aide d’un grattoir cellulaire. En inclinant la plaque/le flacon à environ 45 degrés, il sera plus facile de rassembler les lysats cellulaires dans leurs tubes correspondants.
- Versez 1 ml de lysat cellulaire par tube dans trois tubes de 1,5 ml. Ces tubes seront marqués de l’état et de la réplique comme indiqué à l’étape 3.1.
7. Tirage vers le bas
- Centrifugez les tubes de 1,5 mL à 11 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes (A).
- Prélever une aliquote de ce surnageant par condition dans différents tubes (B), soit 50 μL par tube. Ajouter 4 tampons Laemmli (16,6 μL pour 50 μL de lysat) et congeler à -20 °C. Ces lysats serviront d’échantillons habituels de Western blot.
- Homogénéisez très bien l’agarose NeutrAvidin en l’agitant doucement. Coupez les pointes des pointes de pipette pour augmenter leur diamètre et améliorer le pipetage des billes. Ajouter 50 μL d’agarose neutravidine par mL de lysat cellulaire dans les tubes (A).
- Incuber à 4 °C pendant la nuit en agitant très doucement pour permettre à NeutrAvidin d’interagir avec les BCPP liés à leurs partenaires intracellulaires.
- Centrifuger à 3 000 x g pendant 1 min à 4 °C pour recueillir le complexe de NeutrAvidin avec des protéines.
- Retirez soigneusement les surnageants et transférez-les dans des tubes propres (C). Conservez-les pour les utiliser au cas où le tirage ne réussirait pas.
- Étapes de lavage : ajoutez un tampon de lyse frais aux granulés (tubes A), remettez en suspension par inversion et répétez les étapes 7.6 et 7.7 cinq fois de plus. Tous ces surnageants peuvent être jetés.
- Retirer les surnageants et ajouter 2 tampons Laemmli au volume final souhaité (40 μL par tube de 1,5 mL pour les granulés obtenus à partir de flacons de 2 cm de cellules confluentes).
- Éluer à 100 °C pendant 5 min pour dissocier les interactions entre protéines et centrifuger pendant 30 s à 8 200 x g pour granuler les billes de Neutravidin.
- Apportez les surnageants, contenant les protéines dissociées, avec les extrémités capillaires dans de nouveaux tubes (D). Les billes peuvent être conservées au cas où il serait nécessaire de répéter les étapes d’élution.
note: Les surnageants (tubes D) sont maintenant prêts à être chargés en Western blot ou à geler à -20 °C.
