1. Transformation de la levure
- Récolter les levures par centrifugation (en tubes de 50 ml) à 1 500 x g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant, remettre chaque pastille en suspension dans 5 ml de H2O stérile et les regrouper ensemble.
- Centrifuger à nouveau à 1 500 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant. Mettre en suspension la pastille de levure dans 1 ml de LiAc/TE.
fraîchement préparé et stérile
note: Utilisez des cellules de levure compétentes dans l’heure suivant la préparation.
- Préparez des échantillons de plasmides (dans des tubes de 1,5 ml) en ajoutant 200 ng d’ADN plasmidique pour les transformations uniques, ou 0,5 à 1 μg de chaque ADN plasmidique pour les co-transformations, et 100 μg d’ADN porteur de testicules de hareng (bouilli pendant 20 min et refroidi sur de la glace juste avant utilisation).
REMARQUE : Inclure un témoin positif, par exemple, levure co-transformée avec pVA3 (codant pour la fusion de l’ADN-BD GAL4 avec la protéine p53) et pTD1 (codant pour la fusion de GAL4 AD avec l’antigène T SV40).
- Ajouter 100 μl de la suspension de levure compétente fraîchement préparée et 600 μl de 1x solution LiAc/PEG (8 ml de PEG 3350, 1 ml de TE mère, 1 ml de LiAc de base), et agiter pendant ~30 sec. Incuber à 30 °C pendant 30 min en agitant à 200 tr/min.
- Ajouter 80 μl de diméthylsulfoxyde (concentration finale de 10 % v/v) et bien mélanger par inversion douce. Choc thermique pendant 15 min dans un bain-marie à 42 °C en mélangeant toutes les 2 à 3 min.
- Réfrigérer la suspension cellulaire sur de la glace pendant 2 min et centrifuger à 14 000 x g pendant 15 sec à RT pour récupérer la levure.
- Mettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μl de 1x TE et la plaque sur des plaques de milieu SD minimal appropriées pour une croissance sélective (milieu dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir une pression sélective sur l’appât et les plasmides cibles).
- Incuber les plaques à l’envers à 30 °C jusqu’à ce que les colonies aient ~2 mm de diamètre (généralement 4 à 5 jours). Les plaques peuvent être conservées à 4 °C pendant 2 à 3 semaines ; pour un stockage plus long, faites des stocks de glycérol et stockez-les à -80 °C.
note: Vérifier que les protéines d’appât et de cible sont exprimées dans la levure par immunotransfert et qu’elles n’ont pas d’activation autonome du gène rapporteur lorsqu’elles sont exprimées séparément dans la levure.
- Ajouter 100 μl de la suspension de levure compétente fraîchement préparée et 600 μl de 1x solution LiAc/PEG (8 ml de PEG 3350, 1 ml de TE mère, 1 ml de LiAc de base), et agiter pendant ~30 sec. Incuber à 30 °C pendant 30 min en agitant à 200 tr/min.
- Ajouter 80 μl de diméthylsulfoxyde (concentration finale de 10 % v/v) et bien mélanger par inversion douce. Choc thermique pendant 15 min dans un bain-marie à 42 °C en mélangeant toutes les 2 à 3 min.
- Réfrigérer la suspension cellulaire sur de la glace pendant 2 min et centrifuger à 14 000 x g pendant 15 sec à RT pour récupérer la levure.
- Mettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μl de 1x TE et la plaque sur des plaques de milieu SD minimal appropriées pour une croissance sélective (milieu dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir une pression sélective sur l’appât et les plasmides cibles).
- Incuber les plaques à l’envers à 30 °C jusqu’à ce que les colonies aient ~2 mm de diamètre (généralement 4 à 5 jours). Les plaques peuvent être conservées à 4 °C pendant 2 à 3 semaines ; pour un stockage plus long, faites des stocks de glycérol et stockez-les à -80 °C.
REMARQUE : Vérifier que les protéines d’appât et de cible sont exprimées dans la levure par immunotransfert et qu’elles n’ont pas d’activation autonome du gène rapporteur lorsqu’elles sont exprimées séparément dans la levure.
2. Papier filtre Colony-lift β-Gal Dosage
- Préparez les tampons suivants :
- Préparez un tampon Z contenant 100 mM de Na2HPO4, 40 mM de NaH2PO4, 10 mM de KCl et 1 mM de MgSO4 ; ajustez le pH à 7,4. Stériliser à l’autoclave et conserver chez RT.
- Préparez le tampon X-Gal en dissolvant le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside à 20 mg/ml dans du N,N-diméthylformamide, et conservez-le à l’obscurité à -20 °C. Préparez la solution de tampon Z/X-Gal. Préparez le tampon avant l’utilisation en mélangeant X-Gal à 0,33 mg/ml et β-mercaptoéthanol à 0,27 % v/v dans le tampon Z. Utilisez 2,5 ml par échantillon.
- Ajoutez 2,5 ml de solution Z buffer/X-Gal fraîchement préparée dans une plaque propre de 100 mm et placez-la dans un papier filtre en cellulose.
- Placez un nouveau papier filtre sur la surface de la plaque avec les colonies de levures à doser. Frottez doucement le papier filtre sur la plaque à l’aide d’une pince et laissez agir ~5 min pour que les colonies se fixent.
note: Traitez le témoin positif en parallèle, c’est-à-dire la levure co-transformée avec pVA3 et pTD1.
- Soulevez le papier filtre et plongez-le (avec une pince) dans une flaque d’azote liquide pendant 30 secondes (l’azote liquide doit être manipulé avec précaution ; portez toujours des gants épais et des lunettes de protection). Laissez le papier filtre congelé décongeler à RT pendant ~2 min.
- Placez le papier filtre (côté colonie vers le haut) sur le papier filtre pré-trempé à l’intérieur de la plaque de 100 mm et incubez à 30 °C.
- Vérifiez périodiquement (toutes les ~30 min) l’apparition de colonies bleues.
note: Appât faible : les interactions avec les cibles peuvent prendre plusieurs heures avant de produire un signal bleu positif (éviter une incubation prolongée (>8 heures) qui peut donner des résultats faussement positifs). Pour de meilleurs résultats, utilisez des colonies fraîchement co-transformées, c’est-à-dire cultivées à 30 °C pendant 4 à 5 jours, ~2 mm de diamètre.
