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Article de méthode

Essai de purification d’affinité en tandem pour étudier les interactions protéine-protéine

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8 juillet 2025

Dans cet article

Résumé

Source : Ma, Z., et al. Purification en tandem par affinité de complexes protéiques à partir de cellules eucaryotes. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo présente la purification par affinité en tandem, une technique permettant de purifier les complexes protéiques des cellules eucaryotes afin d’étudier l’interaction protéine-protéine. Le complexe contient deux protéines marquées avec des étiquettes d’épitopes différentes. Lors de la purification du complexe à l’aide de deux résines ayant une affinité pour les deux marqueurs différents de manière séquentielle, la présence des deux protéines dans l’élué confirme l’interaction entre les deux.

Protocole

1. Cellules de placage

  1. Un jour avant la transfection, mettre en boîte 3,5 x 106 cellules HEK293T dans 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine (10 000 U/ml de stock) par boîte de 100 mm. Plaque 3 - 5 100 mm2 plats par expérience/condition pour assurer une récupération suffisante des protéines.
    note: Le nombre de plaques doit être déterminé pour chaque expérience/condition, qui dépendra des niveaux d’expression et de la solubilité du complexe protéique d’intérêt. Alternativement, si une purification à plus grand....

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Résultats

Tableau 1 : Plasmides utilisés dans cette étude. CycT1 et CDK9 ont été ligaturés dans les vecteurs plasmidiques pcDNA/4TO-STREP et pcDNA/4TO-FLAG. Ces constructions ont été transformées en cellules compétentes DH5α et plaquées sur des plaques LB-Ampicilline. Les colonies ont été sélectionnées, cultivées et criblées. Les clones ligaturés avec succès ont été vérifiés par séquençage de Sanger et la combinaison de la digestion de restriction et de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Pour CycT1, nous avons utili.......

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)Fisher ScientificSH30022FS
Sérum fœtal bovinHycloneSH30071
Pénicilline/streptomycineFisher ScientificMP091670049
PolyJetFisher ScientificRéférence 50-478-8
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseRoche11836153001
STREP-Tactin SuperflowIbaRéférence 2-1208-010
Tampon d’élution STREP-tagIbaRéférence 2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Gel d’affinitésigmaSLBQ1981V
Corning 100mm × 20 mm style Dish polystyrène apyrogène traité pour culture cellulaire 20/manchonCorning430167
Protéine Lo-Bind EppendorfFisher ScientificTél. : 13-698-794
Mélangeur Vortex NumériqueFisher ScientificTél. : 02-215-370
Support en mousse micro-tube 48 trousFisher ScientificTél. : 02-215-386
Rôtissoire shaker LabquakethermoRéf. 415110

Mots-clés

Interaction prot ine prot inemarquage d pitopeStrep tag FLAG tagisolement de complexe prot iquepurification s quentielleliaison la streptavidineanticorps anti FLAGlution comp titivepr paration de lysat cellulaire