Essai de purification d’affinité en tandem pour étudier les interactions protéine-protéine

Résumé

Source : Ma, Z., et al. Purification en tandem par affinité de complexes protéiques à partir de cellules eucaryotes. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo présente la purification par affinité en tandem, une technique permettant de purifier les complexes protéiques des cellules eucaryotes afin d’étudier l’interaction protéine-protéine. Le complexe contient deux protéines marquées avec des étiquettes d’épitopes différentes. Lors de la purification du complexe à l’aide de deux résines ayant une affinité pour les deux marqueurs différents de manière séquentielle, la présence des deux protéines dans l’élué confirme l’interaction entre les deux.

Protocole

1. Cellules de placage

1. Un jour avant la transfection, mettre en boîte 3,5 x 10⁶ cellules HEK293T dans 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine (10 000 U/ml de stock) par boîte de 100 mm. Plaque 3 - 5 100 mm² plats par expérience/condition pour assurer une récupération suffisante des protéines.
   note: Le nombre de plaques doit être déterminé pour chaque expérience/condition, qui dépendra des niveaux d’expression et de la solubilité du complexe protéique d’intérêt. Alternativement, si une purification à plus grande échelle est nécessaire, les lignées cellulaires peuvent être adaptées pour se développer en suspension dans des flacons tournants, mais cette méthode ne fonctionnera pas pour les transfections transitoires.

2. Transfection de cellules ou induction de lignées cellulaires stables

1. Le lendemain, vérifiez les cellules au microscope. Les cellules doivent être confluentes à 70 à 80 % avant de continuer.
2. Transfectez les cellules avec un mélange total de 7 μg d’ADN plasmidique et 21 μl de réactif de transfection par boîte de 100 mm. Cellules de transfection avec un vecteur exprimant la GFP (Tableau 1) comme contrôle de l’efficacité de la transfection.
   note: Si vous utilisez un HEK293-T-REx ou une lignée cellulaire stable similaire qui induit l’expression de deux sous-unités complexes ou plus en réponse à la doxycycline, l’inducteur devra être ajouté aux cellules et incubé pendant 48 heures. De même, une lignée cellulaire stable qui induit l’expression de la GFP lors de l’ajout de l’inducteur serait également nécessaire à des fins de validation. Passez à l’étape 2.7.
3. Préparez le mélange de transfection par plat de 100 mm. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, mélanger 500 μl de DMEM non supplémenté avec 7 μg d’ADN plasmidique total (correspondant à deux plasmides ou plus). Dans un tube de microcentrifugation séparé, mélanger 500 μl de DMEM non supplémenté avec 21 μl de réactif de transfection. Répétez l’opération pour chaque réaction de transfection.
4. Pipeter la solution de réactif de transfection dans la solution d’ADN plasmidique (ne pas mélanger les solutions dans l’ordre inverse). Mélanger par pipetage au moins 4 fois.
5. Incuber ce mélange à température ambiante pendant 10 à 15 min, mais pas plus de 15 min.
6. Inclinez la plaque pour créer un réservoir de fluide et pipetez soigneusement le mélange de transfection goutte à goutte sur la face intérieure de la plaque sans déranger les cellules. Remettez le plat dans sa position plate d’origine et remuez doucement pour répartir le mélange.
7. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié avec 5 % de CO₂ (cette condition est ci-après appelée « incubateur de culture tissulaire »). Remplacez le support 5 heures après la transfection (facultatif).

3. Vérification de l’efficacité de la transfection ou de l’induction

1. 24 heures après la transfection, visualisez les cellules sous un microscope fluorescent pour vérifier l’efficacité de la transfection (ou l’induction de la lignée cellulaire stable témoin HEK293T-REx exprimant la GFP). Incuber pendant encore 24 heures.

4. Purification d’affinité STREP (STREP AP)

1. Collecte des cellules
   1. 48 heures après la transfection, retirer le milieu et ajouter 8 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide. Pipette de haut en bas pour détacher les cellules de la plaque.
   2. Prélever et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et faire tourner les cellules à 800 x g pendant 4 min à 4 °C.
   3. Retirez le surnageant PBS. Répétez l’essorage (800 x g pendant 1 min à 4 °C) pour éliminer tout PBS résiduel. Conservez la pastille cellulaire à -80 °C pour une utilisation future ou suivez la procédure ci-dessous pour poursuivre la purification des protéines.
2. Lyse des cellules
   1. Remettez les pastilles de cellule en suspension à l’aide de 5 × du volume de pastilles de cellule (~250 μl par plaque) de tampon de lyse passive (PLB : 20 mM de Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl₂, 1 mM de DTT, de comprimé cocktail d’inhibiteur de protéase, de glycérol à 5 % v/v et de NP-40 à 1,0 %) et transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
   2. Agiter brièvement la suspension et nuter pendant 30 min à 4 °C.
   3. Faites tourner la suspension cellulaire à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   4. Transférez les lysats solubles dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et jetez les pastilles de cellules. Conservez 10 % du volume final du lysat soluble sous forme de « STREP AP Input ». Conserver à 4 °C.
3. Équilibrage des billes de streptocoque
   note: Utilisez des billes de STREP pour la première étape AP ! Les complexes tirés vers le bas avec des billes de STREP récupèrent beaucoup plus de protéines que ceux tirés vers le bas avec des billes FLAG.
   1. Prélever (n × 40 μl) + n μl de la suspension de billes de 50 % de streptocoque (n = nombre d’échantillons) et essorer à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C
      REMARQUE : Utilisez des pointes à large ouverture pour pipeter les billes.
   2. Retirez le surnageant et ajoutez 500 μl de PLB dans les billes. Faites nuter le mélange de billes pendant 5 min à 4 °C. Faites-le tourner à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C.
      1. Répétez l’opération pour un total de 3 lavages. Remettre les billes en suspension dans PLB jusqu’à un volume final de n × 40 μl.
   3. Ajouter 40 μl de suspension de billes de streptocoque à 50 % dans chaque échantillon de lysat cellulaire et nuter pendant 2 heures à 4 °C.
4. STREPTOCOQUE AP
   1. Verser la solution à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C.
   2. Retirez le surnageant et stockez-le sous la forme « STREP AP Flow-through (FT) » à 4 °C.
   3. Ajoutez 500 μl de STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5 % de glycérol et 0,2 % de NP-40) aux billes. Nuter le mélange de billes pendant 5 min à 4 °C et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
      1. Répétez l’opération pour un total de 4 lavages.
         note: Avant le quatrième lavage, transférez la solution de billes dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml pour réduire le fond protéique. Cette étape est essentielle.
   4. Ajoutez 500 μl de tampon de lavage II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl et 1 mM EDTA) et équilibrez les billes en inversant les tubes. Essorer à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   5. Éluer la protéine d’intérêt avec 50 μl de tampon d’élution STREP (100 mM de Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA et 2,5 mM de desthiobiotine). Vortex à 800 tr/min pendant 15 min à 4 °C.
   6. Faites tourner les billes à 1 500 x g pendant 1 min à 4 °C. Récupérez le surnageant. Cette fraction correspond à l’échantillon « STREP AP Elution ».
   7. Conservez la fraction des billes à 4 °C pour une deuxième élution, ce qui pourrait donner jusqu’à la moitié de la quantité de protéines obtenue avec la première élution. Aliquote 10 % de l’élution STREP AP pour la coloration à l’argent et/ou le western blot.
5. Équilibrage des perles FLAG
   1. Prélever (n x 16 μl) + n μl de solution de billes FLAG (n = nombre d’échantillons) et essorer à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C
      note: Utilisez des pointes à large ouverture pour pipeter les billes.
   2. Retirer le surnageant et ajouter 500 μL de tampon de lavage FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA et 0,1 % NP-40) aux billes. Essorez à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Répétez l’opération pour un total de 3 lavages.
   3. Remettre les billes en suspension dans le tampon de lavage FLAG jusqu’à un volume final de n x 16 μl.
   4. Ajouter 16 μl de la boue de billes FLAG au reste de l’élution de STREP AP et nuter toute la nuit à 4 °C.

5. FLAG IP

1. Faites tourner la suspension des billes FLAG à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Enregistrez le surnageant et stockez-le en tant que « FLAG IP Flow-through » (FT) à 4 °C.
2. Ajoutez 500 μl de tampon de lavage FLAG à la solution. Nuter pendant 5 min à 4 °C et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Répéter l’opération pour un total de 4 lavages et retirer le surnageant après chaque lavage.
   note: Avant le quatrième lavage, transférez la solution de billes de protéines dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml pour réduire le bruit de fond. Cette étape est essentielle.
3. Retirez le surnageant de l’essorage final et ajoutez 30 μL de tampon de lavage FLAG contenant 200 ng/μl de peptide FLAG dans les billes. Vortex à 800 tr/min pendant 2 h à 4 °C.
4. Faire tourner la suspension à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C. Récolter le surnageant et le stocker à 4 °C sous le nom de « FLAG IP Elution »
   note: Les échantillons d’élution peuvent être confirmés par coloration à l’argent et/ou par western blot à l’aide de protocoles standard, et sont prêts pour d’autres dosages de protéines. Lors de la configuration d’un western blot, exécutez tous les échantillons suivants : (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) FLAG IP FT et (5) FLAG IP Elution. Les volumes chargés devront être déterminés pour chaque expérience. Tous les échantillons et billes collectés peuvent être conservés à 4 °C pour un stockage à court terme et à -80 °C pour un stockage à long terme. Les échantillons de TAP pourraient être analysés par spectrométrie de masse pour vérifier l’identité de leurs composants, pour identifier de nouvelles modifications post-traductionnelles (PTM) et/ou pour découvrir toute nouvelle interaction protéique avec le complexe purifié. À cette fin, après avoir appliqué un gel de coomassie ou une coloration à l’argent, les bandes peuvent être excisées du gel à l’aide d’un scalpel propre. Plusieurs excellentes revues traitant des méthodes de spectrométrie de masse ont déjà été publiées.

Résultats

Tableau 1 : Plasmides utilisés dans cette étude. CycT1 et CDK9 ont été ligaturés dans les vecteurs plasmidiques pcDNA/4TO-STREP et pcDNA/4TO-FLAG. Ces constructions ont été transformées en cellules compétentes DH5α et plaquées sur des plaques LB-Ampicilline. Les colonies ont été sélectionnées, cultivées et criblées. Les clones ligaturés avec succès ont été vérifiés par séquençage de Sanger et la combinaison de la digestion de restriction et de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Pour CycT1, nous avons utili...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	Fisher Scientific	SH30022FS
Sérum fœtal bovin	Hyclone	SH30071
Pénicilline/streptomycine	Fisher Scientific	MP091670049
PolyJet	Fisher Scientific	Référence 50-478-8
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	Iba	Référence 2-1208-010
Tampon d’élution STREP-tag	Iba	Référence 2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Gel d’affinité	sigma	SLBQ1981V
Corning 100mm × 20 mm style Dish polystyrène apyrogène traité pour culture cellulaire 20/manchon	Corning	430167
Protéine Lo-Bind Eppendorf	Fisher Scientific	Tél. : 13-698-794
Mélangeur Vortex Numérique	Fisher Scientific	Tél. : 02-215-370
Support en mousse micro-tube 48 trous	Fisher Scientific	Tél. : 02-215-386
Rôtissoire shaker Labquake	thermo	Réf. 415110