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Pour la présente étude, une protéine de fusion CVN-petit modificateur de type ubiquitine (SUMO) a été utilisée dans des tests immuno-enzymatiques au lieu de CV-N et convient aux tests cellulaires. La protéine HA H3 recombinante du virus de la grippe A est obtenue commercialement (voir le tableau des matières) ou exprimée dans des lignées cellulaires de mammifères HEK293 et des cellules d’insectes infectées par des baculovirus selon les protocoles standard. La protéine de pointe Wuhan-1 est exprimée dans les cellules HEK293 de mammifères. La synthèse du peptide mon-mannosylé (MM) et du peptide di-mannosylé (DM) permet la détection de ligands homogènes à CVN2 et de petites molécules mono-mannosylées.
1. Création de constructions CV-N
- Pour chacun des variants de CVN2 et de la protéine CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), obtenir la construction génique avec une séquence pelB leader N-terminale et un His-tag dans le vecteur pET27b(+) à partir de sources commerciales (voir le tableau 1).
- Obtenir CVN2L0 et ses variantes (V2, V3, V4 et V5 ; Figure 1A,C) à l’arrière-plan d’un gène matrice CVN2L0 constitué de deux séquences d’ADN distinctes pour chaque répétition CV-N.
- Dissoudre l’ADN plasmidique lyophilisé dans de l’eau distillée désionisée stérile (ddH2O) jusqu’à une concentration finale de 100 ng/μL.
2. Préparation de plaques de gélose LB avec des cellules transformées par l’ADN plasmidique
- Préparez le milieu de culture LB-Lennox en dissolvant 10 g/L de peptone, 5 g/L d’extrait de levure et 5 g/L de NaCl dans du jdH2O (voir le tableau des matériaux), et ajustez le pH à 7,4. Effectuer la transformation en E. coli BL21 (DE3) compétent pour chaque variant (V2-V5) par méthode chimique selon un rapport préalablement publié.
- Divisez la solution (900 μL et 100 μL), transférez 100 μL sur des plaques de gélose LB (50 μg/mL de kanamycine) et utilisez délicatement un épandeur de cellules stériles. Incuber les plaques de gélose pendant une nuit à 37 °C.
3. Clonage
- Sous-cloner le gène de CV-N dans les sites NdeI et BamHI de pET11a (voir Tableau des matériaux) pour la transformation (électroporation) en cellules électrocompétentes suivant référence.
4. Mutagénèse dirigée par site
- Générer CVN2L0 et le mutant CVN-E41A en arrière-plan d’un gène modèle CVN2L0 contenant deux séquences d’ADN distinctes pour chaque répétition CV-N.
- Effectuer des mutations à l'aide d'un kit de mutagénèse dirigée (voir le tableau des matériaux) et d'amorces mutagènes spécifiques 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' et 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttttc-3' pour exécuter la PCR.
- Démarrez une série de réactions d’échantillon à l’aide de plusieurs concentrations de matrice d’ADN double brin (ADNdb) allant de 5 à 50 ng (p. ex., 5, 10, 20 et 50 ng de matrice d’ADNdb). Maintenez la concentration de l’amorce constante.
note: Le mélange PCR et le protocole de cyclage thermique sont généralement utilisés comme décrit dans le manuel d’instructions du kit de mutagénèse dirigée par site.
- Ajoutez l’enzyme de restriction DpnI (1 μL, 10 U/μL, voir tableau des matériaux) sous le revêtement d’huile minérale. Mélangez soigneusement et doucement les réactions, faites tourner dans une microcentrifugeuse de table pendant 1 minute et incubez immédiatement à 37 °C pendant 1 h pour digérer l’ADNdb superenroulé parental.
5. Transformation des cellules bactériennes
- Décongelez doucement les cellules super-compétentes XL1-Blue (voir tableau des matériaux) sur de la glace. Pour transformer chaque réaction de contrôle et d’échantillon, aliquotez les cellules super-compétentes (50 μL) dans un tube à fond rond en polypropylène pré-refroidi (14 mL).
- Transférez 1 μL d’ADN simple brin traité au Dpn I (ADNsb) de chaque réaction de contrôle et d’échantillon (ADNsb muté) vers des aliquotes distinctes des cellules super-compétentes, qui synthétisent le brin complémentaire. Agitez soigneusement les réactions de transformation pour les mélanger et incubez les réactions sur de la glace pendant 30 min
note: Avant de transférer l’ADN traité au Dpn I dans la réaction de transformation, il est recommandé de retirer soigneusement toute huile minérale restante de la pointe de la pipette. En tant que contrôle facultatif, l’efficacité de transformation des cellules super-compétentes XL1-Blue doit être vérifiée en mélangeant 0,1 ng/μL du plasmide de contrôle pUC18 (1 μL) avec une aliquote de 50 μL des cellules super-compétentes.
- Appliquer une impulsion thermique aux réactions de transformation à 42 °C pendant 45 s, puis placer les réactions sur de la glace pendant 2 min
note: L’impulsion de chaleur appliquée a déjà été optimisée pour les conditions mentionnées dans les tubes à fond rond en polypropylène (14 ml).
- Ajouter 0,5 mL de bouillon NZY+ (contenant par litre : 10 g d’amine NZ (hydrolysat de caséine), 5 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl, 12,5 mL de 1 M MgCl2, 12,5 mL de 1 M MgSO4, 10 mL de glucose 2 M, pH 7,5 et préchauffé à 42 °C) et incuber les réactions de transformation à 37 °C en agitant à 225-250 tr/min pendant 1 h. Plaquer le bon volume de chaque réaction de transformation (5 μL à partir de la transformation du plasmide témoin ; 250 μL à partir de la transformation de l’échantillon) sur des plaques de gélose LB-ampicilline.
note: Pour les contrôles de transformation et la mutagénèse, répartir les cellules sur des plaques de gélose LB-ampicilline contenant du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, 80 μg/mL) et de l’isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG, 20 mM) (voir le tableau des matériaux). Inoculer 50 mL de cultures cellulaires avec une seule colonie de cellules E. coli transformées pour purifier l’ADN plasmidique muté à des fins d’analyse. La mutagénèse est confirmée par séquençage de l’ADN dans une installation externe.
6. Expression et purification des protéines
- Pour une culture à grande échelle, inoculez une petite quantité de LB (contenant de l’ampicilline) avec une seule colonie de la plaque transformée.
- À l’aide de la culture de nuit, inoculez la culture d’expression avec des additifs, tels que 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4 et 20 mM de glucose, en diluant la culture de graines à 1/100.
- Cultivez les cellules en les secouant vigoureusement à 37 °C. Cultivez les cellules à un Abs 600 nm entre 0,4 et 0,6 (phase mi-logarithmique) avant de refroidir les cellules à 20 °C. Induisez avec 1 mM d’IPTG et cultivez pendant la nuit.
- Ensuite, prélever les cellules par centrifugation à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C, et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans un tampon salin tamponné au phosphate (PBS) et la centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Ensuite, jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettre en suspension la pastille restante dans 10 mL de tampon de lyse et incuber la suspension pendant 1 h à 37 °C.
note: Composition du tampon de lyse : (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 2 % de Triton-X 100, 500 ng/mL de lysozyme, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 1 mM de dithiothréitol, 1 mM de MgCl2, pH 8, voir Tableau des matériaux).
- Soumettez le mélange à deux cycles de congélation-décongélation (-80 °C). Séparer les fractions solubles et insolubles par centrifugation à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C et les analyser à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), en particulier le dodécylsulfate de sodium (SDS)-PAGE (Figure 1B, C).
note: Les cellules peuvent être lysées de plusieurs façons, telles que la congélation-décongélation, la sonication, l’homogénéisation, la lyse enzymatique ou une combinaison de ces méthodes. La purification à partir des corps d’inclusion est recommandée pour recueillir des rendements élevés en protéines.
- Purifier les protéines à l’aide de la chromatographie sur colonne Ni-NTA (voir Tableau des matériaux). Chargez la fraction soluble sur une colonne de billes de Ni-NTA régénérée (1 mL/min). Laver le système avec un tampon TBS (50 mM de Tris, 150 mM de chlorure de sodium, pH 7,5) avant de commencer une pente (0-100 % 500 mM d’imidazole dans le TBS sur 60 min) et de prélever les fractions (1 mL/min). Dialyser les protéines purifiées pour la caractérisation biochimique contre 100 mM de PBS (Figure 1C, D).
- Alternativement, utilisez le gel d’affinité His-Select Ni2+ (voir le tableau des matériaux) dans des tubes de 14 mL pour lier et remettre en suspension le CV-N exprimé par recombinaison dans des solutions tampons avec 20 mM d’imidazole et 250 mM d’imidazole, respectivement. Incuber par lots pendant au moins 30 min.
note: Appliquez ces protéines semi-purifiées dans une colonne préemballée à usage unique pour l’échange de tampons et le nettoyage d’échantillons biologiques, par exemple, des glucides et des protéines, qui peuvent charger 1 à 1,5 mL d’éluat par chromatographie d’affinité métallique immobilisée.
- Transvaser les solutions protéiques dans des tubes de centrifugation à l’aide d’un filtre de coupure de 10 kDa (voir tableau des matériaux) et les concentrer par centrifugation pendant 10 min à 4 500 x g et 4 °C. Pour les mesures SPR, remplacez les solutions d’analyte par 10 mM d’HEPES, 150 mM de chlorure de sodium, 3 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 0,05 % de Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), voir le tableau des matériaux).
- Ajouter ce tampon de fonctionnement SPR à un facteur de dilution de 1:10 et centrifuger quatre fois le volume initial pendant 10 min à 4 500 x g et 4 °C.
- Déterminer la concentration en protéines à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop (voir le tableau des matériaux) sur la base du coefficient d’extinction calculé (20 440 M-1 cm-1) pour la protéine principale CVN2L0 montrant une taille de 23 474 Da. Utiliser le PBS (100 mM, pH 7,0) ou le tampon SPR comme blanc, et mesurer la concentration en protéines à trois étapes de dilution (1:1, 1:10 et 1:100).
7. Spectroscopie SPR
- Utilisez le système SPR à double canal (voir tableau des matériaux) avec tampon de fonctionnement HBS-EP(+) et 10 mM de glycine HCl pH 1,5-1,6 comme tampon de régénération. Allumez l’instrument, le dégazeur, l’échantillonneur automatique et la pompe, et lavez l’ensemble du système avec du ddH20 pendant 1 h. Placez la mémoire tampon prête à l’emploi dans une bouteille séparée.
- Déposez de l’huile d’immersion sur le détecteur et montez une puce de capteur en verre (voir tableau des matériaux) recouverte d’une fine pellicule d’or et sur la face supérieure fonctionnalisée avec de l’hydrogel de carboxyméthyl dextran directement sur le détecteur sous la cellule d’écoulement à trois ports. Corrigez le paramètre en tirant vers le bas handling.
note: C19RBDHC30M hydrogel de carboxyméthyl dextran dérivé de la streptavidine de 200 nm avec une densité moyenne de protéine RBD du coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère biotinylée, est une puce capteur prête à l’emploi avec le ligand pré-immobilisé.
8. Dosage de liaison SPR pour la liaison CV-N à HA, protéine S et RBD
- Immobiliser les ligands protéiques sur les puces de capteur en suivant les étapes ci-dessous.
- Ouvrez une table de course en cliquant sur Formulaire dans la barre de menu et sur Éditeur de table de course dans le logiciel SPRAutoLink intégré (voir Table des matériaux). Choisissez et cliquez sur BASIC_Immobilization dans la liste des tables d’exécution disponibles et suivez les étapes de la procédure expérimentale sur l’écran de l’ordinateur. L’éditeur d’échantillons utilisé est indiqué dans le coin supérieur droit.
- Cliquez sur Sample Set Editor dans la section Formulaire pour remplir la liste des réactifs pour deux racks placés dans l’échantillonneur automatique pour des analyses plus approfondies. Cliquez sur Contrôle direct de l’échantillonneur automatique en tant qu'« outil » dans la barre de menu pour avancer ou ramener les racks à la maison. Choisissez 4 °C comme température de fonctionnement.
note: Le logiciel SPR permet le « SPR Instrument Direct Control » et le « Pump Direct Control » en sélectionnant les outils correspondants, ainsi que la manipulation de l’échantillonneur automatique, et en cliquant sur Formulaire ; Vous pouvez également choisir Exécuter l’éditeur de table, le tracé de données ou le post-traitement pour effectuer l’analyse des données. Les fichiers sont directement enregistrés dans le répertoire par défaut et exportés en tant que scrubber.files à partir de la fenêtre de post-traitement.
- Démarrez la pompe pour infuser ddH20 en cliquant sur Outils et Pump Direct Control et enregistrez les données en cliquant sur SPR Instrument Direct Control, et à chaque fois démarrez dans les nouvelles fenêtres qui apparaissent. Placez les réactifs de couplage (étape 8.3) dans des flacons de 300 μL, placez-les dans les racks de l’échantillonneur automatique et démarrez la table d’exécution en cliquant sur Run.
note: Les surfaces des puces sont soit conditionnées avec un tampon de glycine de 10 mM pH 9,0, soit rincées avec du chlorure de sodium 1 M, un tampon de borate de sodium de 0,1 M pH 9,0 pour conditionner la surface de la puce dérivée de carboxyle pour le mélange d’activation EDC/NHS.
- Pour cette simple interaction protéine-protéine, utilisez la puce CMD500D (voir Tableau des matériaux) pour générer une unité d’indice de micro-réfraction (μRIU) = 2500 - 3000 cellule d’écoulement avec HA immobilisé et μRIU = 400 cellule d’écoulement avec protéine de pointe. À un débit de perfusion de 15 μL/min, injecter un mélange aqueux et égal de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino propyl) carbodiimide 0,4 M (EDC*HCl) et de N-hydroxysuccinimide 0,1 M (NHS) en appliquant les étapes séquentielles suivantes.
- Recharge de la pompe à 25 000 μL/min, réglage de la ligne de base pendant 30 s, injection de 90 μL de solution d’activation de l’échantillon (EDC/NHS) sur un temps de contact de 6 minutes, puis maintien pendant 5 minutes supplémentaires.
- Répétez ce cycle après avoir fonctionné pendant 1 min à 10 μL/min sur la cellule d’écoulement gauche uniquement (en bleu) pour injecter et immobiliser les peptides synthétisés chimiquement, HA, et la protéine de pointe à 20 μg/mL, et permettre l’ajustement ultérieur de la ligne de base avec ddH2O pendant 1,5 min avant de tremper la surface de la puce activée avec 1 M d’éthanolamine HCl pH 8,5.
- Basculez les tubes de l’échantillonneur de liquide au dégazeur de ddH20 dans la bouteille avec HBS-EP(+) (Figure 2).
- Analysez les capteurs SPR.
- Pour réaliser des études cinétiques, utilisez différentes concentrations d’analytes (10-5-10-8 M), avec une étape de régénération après chaque injection et des mesures à blanc après différents analytes. Modifiez le débit à 10 μL/min et commencez les injections pendant 4 minutes de temps de contact, puis 5 minutes de génération de base, et deux étapes de régénération de 2 min chacune avec un intervalle de 30 s.
- Injectez la solution tampon pour les mesures à blanc dont les sensorgrammes sont soustraits des analyses d’échantillons afin de normaliser les différentes concentrations de protéines.
- Cliquez sur Formulaire, faites défiler vers le bas et passez à « Post-traitement » en cliquant sur ce mode de fonctionnement. Cliquez sur Ajouter pour sélectionner les courbes de liaison générées au fil du temps dans le formulaire de tracé de données pour chaque cellule de flux, et exportez la superposition sous forme de fichier de curseur (.ovr). Cliquez sur Fichier pour ouvrir les options d’enregistrement du fichier. Obtenez des courbes de réponse en alignant les courbes gauche et droite et en soustrayant les signaux du second canal de référence de ceux du canal ligand.
note: Les données sont exploitées en « Post-Processing » en définissant des sensorgrammes par calcul. Il est placé dans une superposition de sensorgrammes à partir de cellules d’écoulement gauche et droite, ou représenté sous forme de sensorgrammes à partir de la différence des deux canaux.
- Nettoyez l’ensemble de la fluidique avec un tampon de glycine de 50 à 100 mM pH 9,5, de l’eau et de l’éthanol à 20 % avant et après les mesures de liaison pour éliminer les traces de sel ou de contamination protéique, ou plus strict, avec 0,5 % de SDS et de glycine.
note: Pour éviter d’endommager l’instrument, il est recommandé de vérifier la stabilité mécanique de la puce de verre avant de réinsérer la cartouche de puce dans l’instrument si les puces ont été stockées sous un tampon ou à 100 % d’humidité.
Tableau 1 : Données cinétiques obtenues à partir de capteurs SPR pour la liaison des variantes de liaison CVN2L0 et Cys-Cys V2, V4 et V5 à HA à l’aide d’un modèle de liaison Langmuir 1:1. KD [M] = koff/kon ou kd/ka. Toutes les données sont générées à 25 °C dans la mémoire tampon HBS-EP(+).
| Analyte | ksur [M-1*s-1] | koff [s-1] | KD |
| CVN2L0 | 5.1 E3 | 1.3 E-3 | 255 nM |
| V2 | 4,0 E3 | 1.1 E-3 | 275 nM |
| V4 | 1.2 E3 | 1.3 E-3 | 11 μM |
| V5 | 1.2 E3 | 5.8 E-2 | 5 μM |
