La résonance magnétique nucléaire pour étudier les interactions protéine-protéine au niveau atomique

Résumé

Source : Winkelaar, G., et al. Mesure des interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse à l’échelle microscopique (MST). J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit la technique de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire permettant d’étudier les interactions protéine-protéine entre 15 protéines d’envoplakine de type sauvage et mutantes ¹⁵N-marquées et la protéine vimentine non marquée. L’interaction réussie entre l’envoplakine de type sauvage et la vimentine conduit à un élargissement important des raies et à la disparition des pics dans les spectres RMN, tandis que l’absence d’interaction entre l’envoplakine mutée et la vimentine entraîne des pics bien résolus dans les spectres RMN.

Protocole

1. Méthodes RMN

1. Préparation d’échantillons RMN
   1. Purifier ¹⁵protéines de type sauvage marquées N ou R1914E E-PRD à l’aide de 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7. Les solutions mères de protéines varient généralement de 0,3 à 1 mM avec des volumes d’environ 1 mL.
      note: Les protéines peuvent être concentrées à >100 μM à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration centrifuge MWCO de 3 kDa, 5 mL pour amener la concentration dans une plage appropriée pour la préparation des échantillons.
   2. Purifier un échantillon de protéine VimRod non marquée à l’aide de 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7.
   3. Dans un volume final de 500 μL, ajouter la protéine E-PRD de type sauvage ou mutante à une concentration finale de 100 μM, l’oxyde de deutérium (D₂O) à une concentration finale de 10 % (v/v) et le DSS (acide 4,4-diméthyl-4-silapentane-1-sulfonique) à une concentration finale de 20 μM. Porter le volume de l’échantillon à 500 μL à l’aide de 20 mM de Tris-HCl, 1 mM DTT et pH 7. La préparation représentative des échantillons est décrite dans le tableau 1.
      note: La résonance 0 ppm de la DSS est utilisée pour calibrer ^lesdécalages chimiques 1 H ainsi que pour le référencement indirect des décalages chimiques ¹⁵N de la protéine. D₂O est utilisé pour le signal de verrouillage du deutérium afin de maintenir le spectromètre en fonctionnement à un champ magnétique net constant.
   4. Prélever un deuxième échantillon d’E-PRD, de D₂O et de DSS comme à l’étape précédente et ajouter VimRod à une concentration finale de 50 μM avant de porter le volume à 500 μL.
   5. Transférez les échantillons de 500 μL dans des tubes RMN de 5 mm de large pour l’expérience.

2. Configuration expérimentale de la RMN

1. Allumez le flux d’air avec la commande d’éjection « ej », cela fera remonter l’échantillon de l’aimant. Maintenant, placez l’échantillon dans une toupie sur le dessus de l’aimant près de l’ouverture et insérez-le avec la commande « ij ». Attendez que l’échantillon se dépose à l’intérieur de l’aimant avant de continuer.
2. Créez un nouvel ensemble de données à l’aide de la commande « edc » et chargez les paramètres RMN standard ¹H en sélectionnant l’expérience « ZGPR » (Figure 1). Renseignez les champs NAME, EXPNO (numéro d’expérience) et PROCNO (numéro de dossier de données traitées). Sélectionnez le solvant dans le champ « Régler le solvant » et cliquez sur « Exécuter 'getprosol' » pour lire les paramètres standard de la tête de sonde et dépendants du solvant (prosol).
3. Verrouillez l’échantillon sur le solvant deutéré, c’est-à-dire D₂O, à l’aide de la commande « lock » et attendez qu’il ait terminé le balayage et qu’il réalise le verrouillage.
4. Corrigez la fréquence de résonance de l’aimant en accordant l’échantillon à l’aide de la commande d’accord automatique « atma ». Surveillez la courbe d’oscillation jusqu’à ce que le réglage automatique soit terminé.
5. Calage du champ magnétique à l’aide de TOPSHIM (commande « topshim »). Le scintillement est le processus d’ajustement d’un champ magnétique pour obtenir une uniformité autour de l’échantillon. Il est recommandé de stocker les valeurs de shim à l’aide de la commande « wsh » et de les lire à l’aide de « rsh » avant topshim, si vous utilisez des échantillons identiques ou similaires.
6. Ajustez le gain du récepteur à l’aide de la commande « rga » pour obtenir un rapport signal/bruit maximal.
7. Placez le centre du spectre sur le décalage de résonance de l’eau (o1) et réglez l’impulsion de protons à 90 degrés (p1) à haute puissance à l’aide de « calibo1p1 ».
8. Collectez le spectre du proton à l’aide de la commande zero go « zg » et traitez avec « efp » qui comprend la multiplication exponentielle (« em »), la décroissance à induction libre (FID) incorporant l’élargissement de ligne, la transformation de Fourier « ft » de FID et « pk » pour appliquer la correction de phase.
9. Appliquez la correction de phase automatique « apk » et la correction de base automatique « absn » en utilisant l’option polynomiale sans intégration.
10. Créez un nouveau jeu de données (comme dans la version 1.2.2) pour l’expérience SOFAST HMQC en sélectionnant « SFHMQC3GPPH » dans l’expérience.
11. Copiez les impulsions optimisées P1 et O1 à partir du spectre de protons et remplissez les impulsions dépendantes de P1 à l’aide de la commande « getprosol 1H p1 plw1 », où p1 est la valeur P1 optimisée et plw1 est le niveau de puissance pour P1.
12. Optimisez la constante CNST54 pour définir le décalage pour le décalage chimique de l’amide et CNST55 pour définir la bande passante afin d’englober les régions spectrales d’intérêt, ce qui permet d’optimiser le gain du récepteur (Figure 2). Pour sélectionner ces paramètres, extrayez le premier FID (décroissance à induction libre) du spectre bidimensionnel et recherchez le signal observé pour les définir. De plus, faites varier le délai de relaxation (D1), le nombre de balayages (NS) et les balayages factices (DS) pour obtenir une sensibilité de signal acceptable avec la commande « gs », qui permet à go and scan de surveiller la qualité des données en temps réel.
13. Enregistrez les spectres à l’aide de Zero Go « zg ».

Table 1. Préparation d’échantillons RMN.

échantillon	1 mM E-PRD dans le tampon A (μL)	1mM VimRod dans le tampon A1 (μL)	Zone tampon A (μL)	200 μM DSS en D2O (μL)	Tampon B2 (μL)	Volume total (μL)
E-PRD seul	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1Tampon A : 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2Tampon B : 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7

Résultats

Figure 1 : Capture d’écran de la configuration de l’expérience RMN. La fenêtre affichée est utilisée pour configurer une expérience standard afin de collecter un ensemble de données HSQC. Les paramètres de l’expérience sont lus à côté de l’expérience. L’expérience ZGPR présentée est choisie comme première expérience pour charger les paramètres protons standard et dépendants du solvant. La fenê...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure d’ammonium (15N, 99 %)	Laboratoires d’isotopes de Cambridge	NLM-467	Marquage isotopique pour la RMN
D2O, oxyde de deutérium (D, 99,8 %)	Laboratoires d’isotopes de Cambridge	DLM-2259	Préparation d’échantillons RMN
DSS, 2,2-diméthyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 de sodium (D,98 %)	Laboratoires d’isotopes de Cambridge	DLM-8206	Référence pour la RMN
Tubes RMN de précision de 5 mm, 7" de long	SJM/Deutérotubes	BOROECO-5-7	Tubes RMN
Spectromètre RMN (14,1 Tesla)	Bruker		Acquisition de données RMN
Sonde cryogénique TCI 5mm z-PFG	Bruker		Acquisition de données RMN
logiciel
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		Traitement des données RMN