La résonance magnétique nucléaire pour étudier les interactions protéine-protéine au niveau atomique

Dans cet article

Résumé

Source : Winkelaar, G., et al. Mesure des interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse à l’échelle microscopique (MST). J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit la technique de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire permettant d’étudier les interactions protéine-protéine entre 15 protéines d’envoplakine de type sauvage et mutantes ¹⁵N-marquées et la protéine vimentine non marquée. L’interaction réussie entre l’envoplakine de type sauvage et la vimentine conduit à un élargissement important des raies et à la disparition des pics dans les spectres RMN, tandis que l’absence d’interaction entre l’envoplakine mutée et la vimentine entraîne des pics bien résolus dans les spectres RMN.

Protocole

1. Méthodes RMN

Préparation d’échantillons RMN
1. Purifier ¹⁵protéines de type sauvage marquées N ou R1914E E-PRD à l’aide de 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7. Les solutions mères de protéines varient généralement de 0,3 à 1 mM avec des volumes d’environ 1 mL.
  note: Les protéines peuvent être concentrées à >100 μM à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration centrifuge MWCO de 3 kDa, 5 mL pour amener la concentration dans une plage appropriée pour la préparation des échantillons.
2. Purifier un échantillon de protéine VimRod non marquée à l’aide de 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7.....

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Résultats

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Figure 1 : Capture d’écran de la configuration de l’expérience RMN. La fenêtre affichée est utilisée pour configurer une expérience standard afin de collecter un ensemble de données HSQC. Les paramètres de l’expérience sont lus à côté de l’expérience. L’expérience ZGPR présentée est choisie comme première expérience pour charger les paramètres protons standard et dépendants du solvant. La fenê.......