Utilisation de l’affichage des phages pour sélectionner des protéines ayant une forte affinité pour une protéine cible

Résumé

Source : Zhang, W., et al., Utilisation de l’affichage des phages pour développer des modulateurs variants de l’ubiquitine pour les ligasses E3. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique d’affichage des phages pour isoler des phages pré-modifiés exprimant des protéines ayant une grande affinité pour la protéine cible.

Protocole

1. Préparer la bibliothèque de phages

1. Décongelez la bibliothèque de phages sur de la glace et diluez-la à 100 fois la diversité de la bibliothèque dans PBS. Par exemple, si la diversité de la bibliothèque est de 1 x 10¹⁰ et que la concentration de la bibliothèque est de 1 x 10¹³, diluez la bibliothèque de sorte que la concentration soit de 1 x 10¹². Pour les bibliothèques utilisées ici, diluez-les 10 fois dans PBS en combinant 1 mL de la bibliothèque avec 9 mL de PBS.
   note: La diversité des bibliothèques aurait dû être déterminée lors de la création de la bibliothèque et ne peut pas être facilement évaluée autrement. La concentration de la banque peut être déterminée en inoculant des cellules E. coli dans la phase mi-log (OD600 2. Afficher le phage à la ou aux protéines cibles
   1. Contrôle facultatif : Ajouter 100 μL de bibliothèque de phages à chaque puits enrobé de la plaque de contrôle. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec une agitation orbitale de 300 tr/min et transférer la bibliothèque de la plaque de contrôle à la plaque cible.
   2. Retirez le tampon PB de la plaque cible et ajoutez 100 μL de la bibliothèque de phages dans chaque puits enrobé.
   3. Incuber à température ambiante (~20-25 °C) pendant 1 h avec agitation orbitale à 300 tr/min.

   3. Éluer autour d’un phage

   1. Retirez la bibliothèque de phages et lavez les puits enrobés quatre fois avec un tampon PT. Retournez l’assiette et tapotez sur une serviette en papier pour retirer les dernières gouttes.
      note: Si plusieurs protéines cibles sont enrobées sur une seule plaque, essayez de minimiser l’écoulement de toutes les solutions ultérieures entre les puits.
   2. Ajouter 100 μL de HCl de 0,1 M dans chaque puits enrobé et incuber à température ambiante pendant 5 min avec une agitation orbitale de 300 tr/min.
   3. Neutralisez le pH en ajoutant 12,5 μL de 1 M de Tris-HCl (pH 11) dans chaque puits enrobé.
   4. Regrouper le phage élué des 8 puits dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Pipeter de haut en bas pendant le transfert pour rendre les solutions homogènes et aspirer tout le liquide des puits.
   5. Ajouter 10 % de BSA au phage élué mélangé jusqu’à une concentration finale de 1 %. Pour un volume d’élution typique de 950 μL, ajoutez 95 μL de BSA à 10 %. Conserver à 4 °C. Il s’agit de la sortie du premier tour.

   4. Préparation pour les tours de sélection suivants

   1. Préparez une culture de graines pour la culture du phage en vue de la prochaine ronde de sélection, comme à l’étape 1.1.
   2. Enduire la plaque pour le troisième tour de sélection comme à l’étape 1.2 avec les modifications notées ci-dessous.
      1. N’enrobez que quatre puits par protéine dans une plaque de liaison de 96 puits. Utilisez la moitié du contenu des tubes « ronds 2/3 » ou « ronds 4/5 » pour le tour approprié. Diluez le contenu de ces tubes au besoin, afin d’éviter que les protéines ne se déposent hors de la solution.
   3. Préparez l’entrée de phage pour le prochain tour de sélection.
      1. Utilisez la moitié de la sortie ronde pour inoculer 3 mL de cellules en phase mi-loglog. Pour une sortie ronde typique, inoculer avec 500 μL de la sortie.
      2. Incuber à 37 °C pendant 30 min avec agitation orbitale à 200 tr/min.
      3. Ajouter le phage auxiliaire M13K07 à une concentration finale de 1 x 10¹⁰ PFU/mL.
      4. Incuber à 37 °C pendant 1 h avec agitation orbitale à 200 tr/min.
      5. Transférez la totalité des 3 ml de culture dans 30 ml de 2YT/carb/kan. Cultiver pendant la nuit à 37 °C avec une agitation orbitale de 200 tr/min.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système de mini-tubes Axygen (0,65 ml, stérile, 96/rack, 10 racks/paquet)	Fisher Scientific	Tél. : 14-222-198	Articles en plastique
Milieu de culture déshydraté BD Difco : Bouillon LB, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	Référence : DF0446-17-3	Préparation des plaques pour le titrage
Albumine sérique bovine (BSA), fraction V	BioShop Canada	ALB001	Composant tampon
Sel de carbenicilline disodique 89,0-100,5 % anhydre	Millipore-Sigma	Réf. C1389-5G	Culture de cellules infectées par des phagemides
Agitateur de microplaques numérique compact	Fisher Scientific	Tél. : 11-676-337	appareil
Ruban d’étanchéité en aluminium pour microplaques Corning	Fisher Scientific	Tél. : 07-200-684	Scellement des stocks de glycérol de phage
Gélose déshydratée	Fisher Scientific	Référence DF0140-01-0	Préparation des plaques pour le titrage
DS-11 Spectrophotomètre/fluorimètre	DeNovix	DS-11 FX+	appareil
Greiner Bio-One CellStar 96 puits, non traitée, microplaque à fond en U	Fisher Scientific	7000133	Articles en plastique
acide chlorhydrique	Fisher Scientific	Réf. A144-500	chimique
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R E. coli chimiquement compétent	Fisher Scientific	C854003	Souche bactérienne pour l’infection par les phages
Sulfate de kanamycine	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culture de cellules auxiliaires infectées par des phages M13K07
M13KO7 Phage auxiliaire	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	N0315S	Permettre l’emballage et la sécrétion de phagemides
MaxQ 4000 Agitateur orbital de paillasse	Fisher Scientific	Tél. : 11-676-076	appareil
Microplaque Nunc MaxiSorp 96 puits, fond plat	Technologies de la vie	Tél. : 44 2404-21	Articles en plastique
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10X	Fisher Scientific	BP3994	Composant tampon/milieu de remise en suspension de phage
Films polyester pour ELISA et incubation	VWR	Référence 60941-120	Recouvrement des microplaques pendant l’incubation
Polyéthylène glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Précipitation des phages
chlorure de sodium	Millipore-Sigma	S3014	Précipitation des phages
Tubes de culture en plastique stériles : polypropylène translucide	Fisher Scientific	14-956-1D	Culture des entrées de phages
Chlorhydrate de tétracycline	Fisher Scientific	BP912-100	Culture de cellules E. coli OmniMax
Base Tris	Fisher Scientific	BP1525	Solution de phage éluée neutralisante
Poudre de tryptone	Fisher Scientific	Réf. BP1421-2	Composant de milieu de croissance cellulaire
Préadolescent 20	Fisher Scientific	BP337500	Composant tampon
Extrait de levure	Fisher Scientific	BP1422-2	Composant de milieu de croissance cellulaire