Spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour étudier l’homo-oligomérisation des protéines

1. FKBP12 F36V -mVénus Purification

1. Cellules pLysS transformées (DE3) avec vecteur pET22b contenant des FKBP12F36V12 humaines monomérisées et des marqueurs N-terminaux His6 et mVenus (vecteur disponible sur demande). Déposer les cellules sur une gélose LB complétée par 50 μg/mL d’ampicilline et 34 μg/mL de chloramphénicol.
2. Transférez les colonies transformées dans une culture de démarrage de 100 mL LB et faites-les pousser pendant 16 à 20 heures à 37 °C en agitant.
3. Diluer la culture de démarrage dense (OD600 >1) 1:100 dans un milieu LB (2 lots de 500 ml) et faire croître pendant 2 à 3 heures jusqu’à OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 tr/min).
4. Cultures fraîches sur glace. Induire avec 250 μM IPTG et cultiver pendant 16 à 20 heures à 21 °C, 200 tr/min.
5. Récoltez les cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 20 minutes.
6. Remettre la pastille en suspension dans 40 mL de tampon A IMAC (20 mM de phosphate de sodium pH 7,5, 500 mM de NaCl, 3 mM d’imidazole, 1 mM de β-mercaptoéthanol) complété par des inhibiteurs de protéase sans EDTA (1 comprimé par pastille cellulaire).
7. Cellules sonicates (500 watts, 20 kHz, 40 % d’amplitude, 9 s de marche, 11 s d’arrêt pendant 15 min) sur de la glace et récolte des matières solubles par centrifugation à 20 000 x g.
8. Transvaser le lysat soluble dans une fiole conique et ajouter 2 mL de résine (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 1 heure avec rotation de 105 tr/min
   note: Le nickel-sépharose peut également être utilisé pour cette étape IMAC.
9. Récoltez la résine et lavez-la avec 250 mL de tampon IMAC A suivi de 500 mL de tampon IMAC B (20 mM de phosphate de sodium pH 7,5, 500 mM de NaCl, 7 mM d’imidazole, 1 mM de β-mercaptoéthanol)
   note: Augmenter à 50 mM d’imidazole si vous utilisez de la résine de nickel sépharose.
10. Éluer la protéine marquée His6 à l’aide du tampon IMAC C (20 mM de phosphate de sodium pH 7,5, 500 mM de NaCl, 300 mM d’imidazole, 1 mM de β-mercaptoéthanol).
11. Injecter sur une colonne d’exclusion stérique (voir Tableau des matériaux) équilibrée en 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl et 1 mM DTT. FKBP12F36V a son élution maximale à 87,71 ml sur la colonne que nous avons utilisée.
12. Évaluer la pureté via SDS-PAGE et regrouper et concentrer si nécessaire.

2. Préparation du réseau de plaques multipuits

1. Décongeler le FKBP12F36V purifié (ou la protéine d’intérêt marquée) à partir de -80 °C.
2. Préparer une solution de 100 nM de FKBP12F36V purifié (milieu, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonicate et centrifugeuse (essorage rapide de 13 000 tr/min) pour éviter la formation d’agrégats.
3. Pipette de 100 à 200 μL dans une chambre d’observation à 8 puits avec un fond en verre.
4. Ajouter le dimériseur BB à des concentrations finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 et 500 nM.
5. À titre de référence, préparez une solution de 100 nM de mVénus seule pour évaluer les effets potentiels d’agrégation et de précipitation et récupérer une valeur de luminosité pour le monomère avec les mêmes paramètres d’acquisition.

3. Acquisition confocale sans étalonnage

1. Démarrez le système confocal (Figure 1). Tout système confocal de microscope à balayage optique équipé de détecteurs numériques ou de détecteurs analogiques bien caractérisés, et capable de maintenir un temps de séjour constant pour chaque pixel acquis fonctionnerait.
2. Réglez la trajectoire du faisceau d’excitation :
   1. Allumez le laser de 514 nm et réglez-le sur une puissance de 20 à 100 nW à la sortie de l’objectif (pour FKBP12F36V-mVenus).
   2. Sélectionnez l’objectif 63X1.4NA ou un objectif à immersion dans l’eau à correction de collier conçu pour le FCS.
   3. Allumez un détecteur HyD, APD ou PMT calibré. Les détecteurs capables de compter les photons sont préférables, car dans ce cas, le calcul de S, décalage et σ₀² n’est pas nécessaire.
   4. Sélectionnez la fenêtre d’émission de 520 à 560 nm
   5. Réglez le sténopé sur 1 unité Airy pour l’émission correspondante ~545 nm.
   6. Réglez le mode d’acquisition sur 16 x 16 pixels
   7. Définissez le temps de séjour du pixel t_de telle sorte qu’il satisfasse l’image t >> T_D >> t_le temps de séjour, où T_D est le temps de séjour de la protéine diffusante et t_frame est la fréquence d’images. Cela correspondait au réglage du temps de séjour à ~13 μs.
      note: Certains fabricants commerciaux avaient des scanners qui ne gardaient pas le temps de séjour par pixel constant. Cette constance est cruciale pour que la méthode fonctionne.
   8. Réglez la taille des pixels à ~120 nm.
   9. Sélectionnez le mode d’acquisition xyt et sélectionnez le nombre d’images à acquérir par acquisition et bien (par exemple 5 000).
   10. Si le système est équipé d’un mode haut débit, introduisez les coordonnées de chaque puits et le nombre d’acquisitions par puits pour automatiser le processus.
       note: Veillez à la présence d’un distributeur d’eau si vous utilisez un objectif d’immersion.
   11. Si le système est équipé d’un système de perfusion, chargez la solution BB et programmez la perfusion pour qu’elle commence juste après la 5000^ème image afin d’évaluer la cinétique de dimérisation tout en acquérant, par exemple, 10 000 images.
3. Ajoutez une goutte d’huile dans l’objectif d’immersion dans l’huile/l’eau si vous utilisez un objectif d’immersion dans l’eau de correction de collier conçu pour le FCS.
4. Montez la chambre d’observation à 8 puits sur la scène.
5. Sélectionnez le puits approprié et concentrez-vous sur la solution.
   note: IMPORTANT : Évitez de faire la mise au point près de la vitre inférieure pour éviter les reflets et la diffusion. Lorsque vous vous concentrez plus profondément sur la solution, déconnectez l’option de mise au point automatique.
6. Lancez l’acquisition et enregistrez la pile d’images résultante au format TIFF.

4. Analyse de la détendance et de la luminosité à l’aide du R Package nandb

1. Dans le cadre d’un contrôle qualité de prétraitement, utilisez ImageJ pour examiner les images et récupérer le profil d’intensité, comme le montre la figure 2a. Ceci est utile pour déterminer s’il y a eu ou non trop de photoblanchiment. S’il y a trop de blanchiment, les données ne se prêtent pas à une analyse plus approfondie.
   note: ImageJ peut également être utile pour convertir des images en TIFF à partir de formats commerciaux. Le logiciel nandb décrit ci-dessous ne peut fonctionner qu’avec des fichiers TIFF.
2. Téléchargez et installez R et RStudio. Il est préférable de télécharger et d’installer R d’abord, puis RStudio.
   note: Ce qui suit est une description de l’utilisation du package R nandb. La connaissance du langage R n’est pas nécessaire pour utiliser nandb, cependant, cela vous facilitera la vie.
3. Installez le paquet nandb.
   1. Ouvrez RStudio et dans la console, tapez install.packages(« nandb ») et attendez l’installation.
4. Faites connaissance avec nandb
   1. Consultez le manuel.
   2. Consultez l’aide intégrée de RStudio pour connaître les différentes fonctions. La fonction la plus susceptible d’être utilisée sera brightness(). Pour afficher le fichier d’aide de cette fonction, tapez ? brightness() sur la console.
5. Calculer la luminosité
   1. Supposons que l’on ait un fichier image sur le bureau appelé img001.tif (notez que 'nandb' ne fonctionne qu’avec les fichiers TIFF). On peut calculer la luminosité de cette image :
      b <- luminosité(« ~/Bureau/img001.tif », tau = « auto »)
      1. Cela attribue la luminosité de l’image à la variable b dans R. Le tau = « auto » garantit que l’image est correctement détendance avant le calcul de la luminosité. La chose la plus courante à faire à partir de là est de calculer la luminosité moyenne ou médiane de l’image. On peut le faire en tapant mean(b) ou median(b). On peut également écrire l’image de luminosité sur le bureau en utilisant
         ijtiff ::write_tif(b, « ~/Bureau/whatever_img_name »)
   2. Supposons que l’on ait un dossier rempli d’images images_folder sur le bureau et que l’on doive calculer la luminosité de ces images et écrire les images de luminosité sous forme de fichiers TIFF. Voir ensuite ?brightness_folder(). Cette fonction traite un dossier entier en une seule fois :
      brightness_folder(« ~/Bureau/images_folder », tau = « auto »)
      C’est particulièrement intéressant pour ceux qui ont un logiciel qu’ils préfèrent à R car tous les fichiers sont traités en une seule commande, puis on peut continuer à travailler avec les images TIFF de luminosité de sortie dans le logiciel de leur choix, qu’il s’agisse d’ImageJ, de Python ou d’autre chose.

Graphique 1. Application du N&B pour détecter les transitions monomère-dimère de protéine en solution. (a) Trajet optique simplifié d’un microscope à balayage laser (LSM) équipé d’une source laser (réglée à 514 nm dans le cas de protéines marquées mVenus) dirigée (flèches bleues) vers un objectif d’immersion (dans notre cas une huile 63X1.4NA) éclairant une solution de 100 nM de solution FKBP12F36V-mVénus. La fluorescence d’émission (flèches vertes) passe à travers un miroir dichroïque et est dirigée vers un filtre passe-bande qui nettoie la lumière d’émission, et un sténopé fixé à 1 unité Airy située juste avant un détecteur numérique ponctuel capable de compter les photons. (b) Un volume confocal d’éclairage est balayé à travers 16 x 16 pixels éclairant des molécules de Vénus uniques de FKBP12F36V-mVénus qui entrent et sortent du volume confocal de forme gaussienne, produisant un ensemble de fluctuations d’intensité de fluorescence. c) Séries d’images acquises au fil du temps

Graphique 2. La détendance automatique est nécessaire pour mesurer avec précision une population de monomères en solution. (a) Une pile de 5000 images de 16 x 16 pixels a été acquise comme décrit dans la section Protocole. L’intensité de la première image est représentée en même temps que le profil d’intensité moyen résolu dans le temps, qui montre les fluctuations à long terme qui pourraient être liées au blanchiment et à d’autres effets solvants et/ou photophysiques. Quelle que soit la cause de ces fluctuations à long terme, elles ont un impact sur les calculs de luminosité et nécessitent donc une réduction des tendances. Sans désatendance automatique, on obtient B = 1,026, alors qu’après désatendance automatique, B = 1,005. De plus, la luminosité sans (panneaux de gauche, deuxième rangée) et avec (panneaux de droite, deuxième rangée) de filtrage lisse est affichée. b) Les mêmes données présentées en a) ont été écartées de tendance et les résultats en termes d’intensité et de luminosité ont été présentés.