$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Clonage
- Déterminez les configurations à cloner et choisissez un éditeur de liens. Marquez les protéines avec les fragments sur l’extrémité N-terminale ou C comme décrit ci-dessous afin qu’ils ne perturbent pas leur bonne localisation. Utilisez un éditeur de liens flexible tel que (GGGGS)x2.
- Marquer génétiquement les protéines d’intérêt pour les fragments de PAmCherry1. Comme une option, utilisez les plasmides de clonage répertoriés dans la liste des matériaux contenant les fragments RN (résidus PAmCherry1 1-159) et RC (Met plus résidus PAmCherry1 160-236) avec des séquences MCS flanquantes.
- Linéariser les plasmides contenant les fragments RN et RC par PCR inverse (ou digestion de restriction) au point d’insertion. Les amorces pour la PCR inverse sont énumérées dans le tableau 1. Vous trouverez ci-dessous un exemple de protocole PCR utilisé dans le laboratoire de l'auteur (voir la liste des matériaux pour les matériaux exacts utilisés dans ce protocole).
- Mélangez la réaction de PCR ensemble, en portant un volume final de 50 μl avec de l’eau : dans un tube PCR à paroi mince, ajoutez l’eau, 25 μl de 2x master mix, 0,5 μl chacune des amorces avant et inverse (20 μM de stock dilué, 0,2 μM de concentration finale) et 1 ng de matrice. Utilisez les conditions de cycle suivantes : 98 °C pendant 30 secondes, 30 cycles de 98 °C pendant 7 secondes et 68 °C pendant 2 minutes, et une extension finale à 72 °C pendant 10 minutes.
- PCR les gènes d’intérêt pour l’insertion dans les plasmides linéarisés contenant des fragments RN et RC. Effectuez la PCR comme à l’étape 1.2.1 avec le temps d’extension à 68 °C. Utilisez des amorces avec des surplombs qui contiennent une séquence de liaison flexible, telle que GGAGGTAGGGAGGTAGGTAGGTGGAGGTGGAAGT pour (GGGGS)x2, et une homologie de 15 paires de bases aux extrémités des plasmides RN et RC linéarisés pour la recombinaison.
note: Les surplombs d’amorces pour les protéines d’intérêt sont présentés dans le tableau 2 si l’on utilise les amorces du tableau 1 pour linéariser le squelette plasmidique.
- Digérer la réaction PCR avec Dpn1 pour éliminer la matrice PCR. Ajoutez 0,5 μl de Dpn1 (20 U/μl) directement aux 50 μl de la réaction PCR. Incuber à 37 °C pendant 1 h et inactiver à chaud à 80 °C pendant 20 min. Si le modèle d’arrière-plan persiste dans les étapes ultérieures, augmentez la quantité d’enzyme ou allongez le temps de digestion.
- Purifier les produits PCR à l’aide d’une colonne de centrifugation telle que décrite par le fabricant.
- Effectuer une réaction indépendante de la ligature pour combiner un plasmide linéarisé contenant un fragment RN ou RC avec le gène d’intérêt. Mesurez la concentration des produits PCR purifiés : combinez 50 ng de plasmide linéarisé et 50 ng du gène d’intérêt avec 1 μl de prémélange enzymatique et portez le volume total à 5 μl avec de l’eau désionisée. Incuber à 50 °C pendant 15 min, placer sur de la glace et ajouter 20 μl de tampon TE.
- Transformer les plasmides recombinants en bactéries compétentes.
- Sélectionnez 2 à 4+ colonies (au choix) pour la culture O/N. Ajouter 5 ml de bouillon LB et 5 μl de kanamycine (50 mg/ml de bouillon) dans un tube à fond rond en polypropylène de 14 ml, et ajouter la colonie bactérienne sélectionnée à l’aide d’une boucle d’inoculation stérilisée. Incuber à 37 °C O/N en agitant à 225 tr/min.
- Congelez 1 ml de culture O/N pour le stock de glycérol et miniprep le reste comme décrit par le fabricant.
- Effectuez un séquençage pour déterminer un bon clone. Si vous utilisez les plasmides de clonage dans la liste des matériaux, utilisez des amorces directes et inverses M13 (dans des réactions séparées) si nécessaire pour obtenir la séquence complète de la construction de fusion. Comparez avec la séquence attendue à l’aide d’un outil d’alignement tel que BLAST du National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Transférez les constructions vérifiées par séquence dans un plasmide d’expression via une réaction de recombinase.
- Ajoutez 75 ng du plasmide de destination, tel que l’ADNpc pour les transfections transitoires ou le pLenti pour l’emballage lentiviral, et 50 ng du plasmide de clonage recombinant à 1 μl de prémélange enzymatique et portez le volume total à 5 μl avec de l’eau désionisée. Incuber à 25 °C pendant 1 heure, puis ajouter 5 μl de tampon TE.
note: Pour l’emballage lentiviral et la génération de lignées cellulaires stables, utilisez un plasmide de destination différent pour chaque construction, par exemple, l’un avec une résistance à la puromycine et l’autre avec de la néomycine. Cela permet une double sélection de cellules transduites. Considérez également le promoteur de chacun, tel que le promoteur constitutif du cytomégalovirus (CMV) pour les niveaux d’expression élevés, ou le CMV avec l’opérateur TetO pour l’expression régulée par la doxycycline accordable.
- Transformez 5 μl en bactéries compétentes et mini-préparez les plasmides comme aux étapes 1.2.6 à 1.2.8, mais en utilisant l’antibiotique approprié (généralement de l’ampicilline).
- Déterminez la configuration BiFC optimale.
- Plasmides d’expression co-transfects dans des cellules U2OS (ou une cellule de choix).
- Ajoutez 350 μl de DMEM sans rouge de phénol et sans antibiotique complété par 10 % de FBS dans chaque puits d’une lame de chambre à fond de verre #1.5 à 8 puits. Plaquez environ 7,5 x 104 cellules par puits de sorte que les cellules soient confluentes à environ 70 % à 90 % le lendemain.
- Le lendemain de l’ensemencement, co-transfectez des plasmides d’expression avec différentes configurations dans chaque puits en utilisant le réactif préféré et tel que décrit par le fabricant.
- Pour chaque puits, ajouter 125 ng de chaque plasmide d’expression dans 50 μl de milieu réduit sans sérum dans un tube de 0,6 ml et pipeter de haut en bas pour mélanger. Ajoutez 1 μl de réactif de transfection au centre du tube et directement dans le milieu. Agitez doucement pour mélanger et laissez reposer la réaction pendant 30 min.
- Réduire de moitié environ le média dans chaque puits de la lame de chambre. Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte dans les puits et agiter doucement pour mélanger. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 à 48 heures. Changez de support le lendemain de la transfection.
- Image de cellules sur un microscope à fluorescence comme dans le Protocole 2 en commençant par l’étape 2.1.4.
note: L’échantillon peut être imagé sur un microscope à fluorescence standard si les niveaux d’expression sont élevés et que la caméra est suffisamment sensible pour la sortie photonique relativement faible de PAmCherry1. Les molécules PAmCherry1 reconstituées peuvent être activées avec un ensemble de filtres ultraviolets (405 nm) avant l’imagerie avec un ensemble de filtres à excitation verte (561 nm).
- Le cas échéant, créer un contrôle négatif en introduisant, par exemple, une mutation ponctuelle dans l’une des protéines d’intérêt qui perturbent l’interaction. Effectuer une mutagénèse dirigée sur le plasmide de clonage de la protéine à muter et de la configuration choisie.
- Générer une lignée cellulaire stable en emballant les constructions dans des particules virales et en infectant les cellules U2OS (ou la lignée cellulaire de votre choix). Envisager un système d’expression inductible (tétracycline) afin que l’expression puisse être induite avant l’imagerie si l’irréversibilité prolongée de BiFC est un problème, ou si une expression accordable est souhaitée.
prudence: Le travail avec des virus est classé au niveau de biosécurité 2. Bien que les dernières générations de systèmes d’emballage viral aient considérablement réduit la probabilité de produire des virus capables de se répliquer, certains risques subsistent. Les références se trouvent à http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/.
- Répétez l’étape 1.2.10 en utilisant un vecteur de destination lenti- ou rétroviral. Augmentez la culture O/N à 100 ml pour une midiprep et une plus grande pureté des plasmides.
- Le jour 1 : Dressez environ 2 x 106 cellules 293T/17 dans un plat de 10 cm pour chaque construction à emballer.
- Le jour 2 : Préparez une réaction de transfection à l’aide d’un réactif de transfection de votre choix et tel que décrit par le fabricant.
- Préparez un prémélange de plasmides d’emballage avec des concentrations finales de 250 ng/μl pour les plasmides d’emballage 1 et 2, et de 100 ng/μl pour l’emballage du plasmide 3 dans de l’eau stérile. Ajouter 10 μl du prémélange de plasmide d’emballage et 2,5 μg du plasmide cible à 1 ml de milieu réduit sans sérum dans un tube à fond rond en polypropylène de 5 ml et pipeter de haut en bas pour mélanger. Ajoutez 20 μl de réactif de transfection au centre du tube et directement dans le milieu.
- Agitez doucement pour mélanger et incubez à RT pendant 30 min. Retirez environ la moitié du milieu des cellules et ajoutez le mélange de transfection au compte-gouttes. Agiter doucement pour mélanger et incuber à 37 °C et 5 % de CO2. Incuber 10 ml de média par plaque dans un tube avec le capuchon desserré pour l’équilibrage de la température et du CO2.
- Le jour 3 : Changez doucement le milieu avec le milieu pré-incubé et retournez les cellules dans l’incubateur. Incuber un autre tube de média avec le capuchon desserré. Remarque : La syncytie, ou la formation de grandes cellules multinucléées, peut être un signe que l’emballage se déroule bien. Cependant, les cellules sont dans un état fragile et peuvent être facilement détachées. Lorsque vous changez de support, inclinez la pipette de manière à ce qu’elle soit horizontale et ajoutez le support goutte à goutte sur un bord de la plaque.
- Le jour 4 : Récoltez le virus en prélevant le média à l’aide d’une seringue et en filtrant à travers un filtre à pores de 0,45 μm dans un tube propre de 50 ml. Remplacez délicatement le média par le média pré-incubé.
- Le jour 5 : Récolter à nouveau comme fait précédemment à l’étape 1.5.3.3 et combiner le filtrat commun dans le même tube de 50 ml. Ajouter 6 ml de concentrateur de virus dans chaque tube et mélanger. Conserver à 4 °C pendant au moins 24 heures jusqu’à ce que le virus précipite.
note: En fonction de la santé des cellules, le virus peut être récolté une troisième fois.
- Concentrer le virus par centrifugation à 1 500 x g pendant 15 min à 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 250 μl de milieu. Les virus peuvent être utilisés immédiatement en cas d’infection ou stockés dans des aliquotes de 50 μl à -80 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à un an.
- Plaquez environ 3 x 10cellules 5 U2OS (ou cibles) par puits dans une plaque à 6 puits (2 ml de DMEM avec 10 % de FBS par puits) pour l’infection, de sorte que les cellules soient confluentes à environ 50 % au moment de l’infection.
- Le lendemain, retirez environ la moitié du support pour qu’il reste environ 1 ml. Co-infecter avec 50 μl de virus concentré pour chaque construction. Ajouter 1 μl de polybrène (8 mg/ml) dans chaque puits. Incuber à 37 °C et 5 % CO2. Changez de milieu le lendemain et incubez pendant un jour supplémentaire avant de choisir l’antibiotique.
note: La quantité de virus à ajouter peut varier en fonction du taux d’infection souhaité. Les virus peuvent être titrés à l’aide de la qRT-PCR.
- Ajoutez des antibiotiques pour sélectionner les cellules infectées. Des puits séparés avec des cellules non infectées qui n’ont pas vu le virus sont nécessaires comme canaris pour tester l’efficacité de la sélection. Incuber pendant 2 à 7 jours, ou jusqu’à ce que la sélection soit terminée.
note: Les concentrations efficaces doivent être titrées au départ, mais elles sont généralement de 1,0 μg/ml pour la puromycine et de 1,0 mg/ml pour la néomycine.
- Étendez les cellules dans une boîte plus grande de 10 cm et passez au protocole 2.
2. Imagerie des cellules fixes
- Préparation d’un échantillon pour l’imagerie
- Nettoyez une lame de chambre à fond de verre #1.5 à 8 puits en ajoutant 250 μl de NaOH 1 M pendant au moins 1 heure et lavez-la soigneusement avec PBS.
note: Les lames de chambre non traitées entraînent généralement un signal de fond élevé. De plus, les cellules peuvent être sensibles au NaOH résiduel et le fait de ne pas nettoyer soigneusement la surface du verre (jusqu’à 10 lavages) peut rendre l’adhésion des cellules difficile. Si nécessaire, incubez la lame de chambre nettoyée avec du PBS O/N après le lavage. Pour les lignées cellulaires sensibles, le placage à une densité plus élevée (par exemple, à 50 % à 60 % de confluence initiale) peut aider.
- Plaquez environ 5,5 x 104 cellules d’expression stable U2OS par puits dans 350 μl de DMEM sans rouge de phénol avec 10 % de FBS afin que les cellules soient saines et ne soient pas trop confluentes lors de l’imagerie.
- Effectuez les traitements nécessaires à l’expérience, tels que l’ajout de tétracycline pour induire l’expression des protéines.
- Fixez les cellules immédiatement avant l’imagerie.
- Avant la fixation, préparez une solution fraîche de paraformaldéhyde (PFA) - 3,7 % de PFA dans 1x PHEM avec 0,1 % de glutaraldéhyde (GA). Pour une solution de 10 ml de PFA, peser 0,37 g de PFA et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 1 ml d’eau distillée et 30 μl de 1 M de NaOH et de vortex. Chauffer à 70 °C et agiter toutes les 1 à 2 minutes jusqu’à ce que le PFA soit complètement dissous.
- Transvasez le PFA dissous dans un tube conique de 15 ml et ajoutez 3,8 ml d’eau distillée, 5 ml de tampon 2x PHEM, 20 μl de glutaraldéhyde à 25 % et un vortex pour mélanger. Stock, 2x tampon PHEM est de 120 mM de PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA et 16 mM MgSO4, avec un pH ajusté à 7,0 avec 10 M KOH. Cette solution fixatrice peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs jours.
prudence: Le PFA et le GA sont tous deux dangereux. Préparez la solution dans une hotte et portez un équipement de protection approprié lorsque vous manipulez les deux produits chimiques. Évitez l’inhalation ou le contact direct avec la peau.
- Retirez le milieu de croissance. Laver rapidement avec 500 μl de PBS et ajouter 250 μl de fixateur PFA par puits. Incuber les cellules pendant 20 min à RT.
- Retirer le fixateur de PFA de l’échantillon et ajouter 350 μl de PBS ou de tampon d’imagerie (100 mM de Tris avec 30 mM de NaCl et 20 mM de MgCl2, pH 8,5) par puits.
- Vortex 100 nm pour briser les agrégats et ajouter 35 μl par puits (dilution finale 10x) pour suivre la dérive de l’étage pendant l’imagerie.
- Acquérir des images
- Allumez le microscope. Allumez les lasers 405 et 561 nm, mais gardez les obturateurs (internes ou externes) fermés à ce stade. Allumez la caméra EMCCD et laissez-la refroidir. Assurez-vous que les filtres 561 nm sont en place.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition et réglez le temps d’exposition sur 100 ms et le gain EMCCD sur 300 (plage de 1 à 1 000).
- Ajoutez de l’huile d’immersion dans l’objectif et fixez l’échantillon à la platine du microscope.
- Avec un champ clair ou le laser de 561 nm allumé (~1 kW/cm2), faites la mise au point sur l’échantillon.
- Pour l’imagerie de Ras et d’autres protéines membranaires, utilisez un objectif apochromatique TIRF 60X avec une ouverture numérique de 1,49 et mettez le microscope en configuration TIRF. Ajustez le laser d’excitation de manière à ce qu’il soit décentré lors de la frappe de l’ouverture arrière de l’objectif TIRF ; Cela fait dévier le laser lorsqu’il atteint l’échantillon. Continuez à régler le laser jusqu’à ce que l’angle critique soit atteint et que le laser soit réfléchi. Recherchez une cellule à imager avec plusieurs particules d’or en vue. Définissez une région d’intérêt qui entoure la cellule (ou une région à l’intérieur de la cellule) et les particules d’or.
Remarque : La technologie TIRF diminue la profondeur de pénétration du laser d’excitation et réduit le signal de fond flou. De plus, la correction de la dérive est susceptible d’être plus précise lorsque plus de particules d’or sont visibles.
- Si disponible, engagez le système de mise au point automatique pour corriger la dérive de l’échantillon dans la direction z. Sinon, ajustez la mise au point manuellement tout au long de l’acquisition si l’image est floue.
- Commencez l’acquisition avec le laser de 405 nm éteint et le laser de 561 nm allumé (~1 kW/cm2) au cas où une activation suffisante se produirait déjà (généralement si les niveaux d’expression sont élevés). Sinon, allumez le laser 405 nm à la puissance d’usine la plus basse (0,02 mW ou 0,01 W/cm2) et augmentez progressivement (0,1 mW à la fois) si nécessaire jusqu’à ce qu’il y ait plusieurs dizaines de molécules par image ou que les molécules individuelles soient bien séparées.
- Au fur et à mesure que l’acquisition de données se poursuit, augmentez progressivement la puissance laser de 405 nm pour maintenir la densité du spot à peu près constante. Remarque : À une puissance d’excitation inférieure de 405 nm, certains PAmCherry1 peuvent déjà être activés. Au fur et à mesure que ces molécules photoblanchissent, la population de molécules photoactivables PAmCherry1 restantes diminue, ce qui nécessite un flux de photons plus élevé pour maintenir la même densité de molécules émettant de la fluorescence dans chaque image.
- Poursuivez l’acquisition d’images jusqu’à ce qu’une puissance élevée de 405 nm (2,5 – 10 W/cm2) n’active plus d’événements d’activation.
note: Le temps total d’acquisition dépend du niveau d’expression et de l’efficacité de la complémentation.
Table 1. Amorces pour la linéarisation des plasmides de clonage contenant des fragments de PAmCherry1. Les plasmides de clonage contenant RN et RC peuvent être linéarisés par PCR inverse au point d’insertion à l’extrémité N-terminale ou C-terminale des fragments. Les séquences sont répertoriées de 5' à 3'.
| Séquence d'amorçage (5' à 3') |
| Plasmide de clonage pour insertion à l’extrémité N-terminale inverse | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN à l’extrémité N-terminale avant | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC à l’extrémité N-terminale avant | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Clonage d’un plasmide pour insertion à l’extrémité C-terminale avant | TAAAAGGGTGGGCGCGCCC |
| RN à partir de l’inverse de l’extrémité C-terminale | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC à partir de l’extrémité C-terminus inversée | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tableau 2. Porte-à-faux pour les amorces de gène d’intérêt qui correspondent aux amorces du tableau 1.
Les 15 paires de bases d’homologie pour la réaction indépendante de la ligature sont générées à partir de surplombs d’amorces. De plus, les porte-à-faux incluent la séquence d’un linker flexible (GGGGS)x2. La séquence flexible de l’éditeur de liens peut être ajoutée aux amorces du Tableau 1 à la place. Les séquences sont répertoriées de 5' à 3'.
| Porte-à-faux pour les amorces du gène d'intérêt (5' à 3') |
| Insertion N-terminale RN ou RC vers l’avant | GAGCTCGGTACCATG |
| Insertion N-terminale RN inverse | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| Insertion N-borne RC inverse | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| Insertion C-terminale RN vers l’avant | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGGAGT |
| Insertion de la borne C RC vers l’avant | GACGAGCTGTACAAGGGAGGGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGGAGT |
| Insertion C-terminale RN ou RC inverse | GCGCCCACCCTTTTA |