Détection des interactions protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence

Résumé

Source : Gijsbers, A., et al. Anisotropie de fluorescence comme outil d’étude des interactions protéine-protéine. J. Vis. Exp. (2016).

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique d’anisotropie de fluorescence pour étudier les interactions entre la protéine du syndrome de Shwachman-diamond (SBDS) marquée au fluorophore et la GTPase 1 de type facteur d’allongement 1 (EFL1). Lors de l’incubation de protéines SBDS avec des concentrations progressivement croissantes d’EFL1, une augmentation constante de l’anisotropie est observée, indiquant une interaction réussie entre les deux protéines.

Protocole

1. Marquage du SBDS-FlAsH avec le colorant fluorescent FlAsH 4',5'-Bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine

1. Mélanger 3 nmol de la protéine SBDS-FlAsH (le marqueur FlAsH correspond au motif tétracystéine Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys génétiquement modifié dans l'extrémité C-terminale de la protéine SBDS recombinante) avec 3 nmol du colorant fluorescéine 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) dans un volume de 5 μl de tampon d'anisotropie (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 10 % de glycérol, 5 mM β-mercaptoéthanol).
2. Laissez la réaction se poursuivre pendant 8 heures à 4 °C. Dialysez l’échantillon contre le tampon d’anisotropie pendant la nuit pour éliminer le colorant libre.
3. Utilisez la loi de Lambert-Beer pour quantifier le % de protéines étiquetées. Mesurer l’absorbance à 280 nm et 508 nm dans un spectrophotomètre à l’aide d’une cuvette en quartz de volume approprié. note: Considérons les coefficients d’absorption molaire suivants (^{M-1 cm-1}) :
   2. Expériences d’anisotropie de fluorescence

   NOTE : Les expériences d’anisotropie ont été réalisées dans un spectrofluorimètre équipé d’une boîte à outils de polarisation et la collecte de données a été effectuée à l’aide du programme d’anisotropie fourni dans le logiciel de l’équipement. La longueur d’onde d’excitation a été réglée à 494 nm avec une bande passante spectrale de 8 nm et l’émission a été enregistrée à l’aide d’un filtre passe-bande de 530±25 nm. Les mesures ont été effectuées à 25 °C dans une cuvette de 200 μl avec une longueur de trajet de 5 mm.

   1. Dans une cuvette de fluorescence, placez 200 μl de SBDS-FlAsH 30 nM dans un tampon d’anisotropie et titrez 2 μl de 30 μM EFL1. Mélangez soigneusement et laissez reposer la réaction pendant 3 minutes avant de mesurer la valeur d’anisotropie.
   2. Répétez l’étape 2.1 jusqu’à ce qu’un volume total de 40 μl d’EFL1 ait été ajouté.

   3. Analyse des données

   1. Ajustez les données au modèle de liaison approprié à l’aide d’un algorithme de régression non linéaire des moindres carrés. Les équations des modèles de liaison les plus courants sont présentées dans le tableau 1.
   2. Évaluez le meilleur modèle qui décrit l’interaction entre les protéines en inspectant les résidus de l’ajustement. Soutenez le modèle choisi par des expériences supplémentaires.

   Table 1. Modèles courants de liaison d’interaction protéine-protéine et les équations mathématiques qui les décrivent.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Base Tris	Formedium	TRIS01	Ultra pur
colorant 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine	ThermoFischer Scientific	Réf. LC6090	Ce kit contient le colorant à étiqueter a Balise FlAsH
Cellule de fluorescence	Hellma Analytics	Référence 111-057-40
spectrophotomètre	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
Spectrofluorimètre	Olis	Non applicable	Olis DM 45 avec boîte à outils de polarisation
2-Mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
NaCl	Formedium	NAC02	chlorure de sodium
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	chlorure de magnésium
glycérol	Sigma-Aldrich	Référence G5516
glycérol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6