Essai de décalage de mobilité électrophorétique pour la détection de complexes facteur de transcription-ADN

Résumé

Source : Hsieh, Y. W. et al., Un protocole optimisé pour le dosage du décalage de mobilité électrophorétique à l’aide d’oligonucléotides marqués par un colorant fluorescent infrarouge. J. Vis. Exp. (2016)

Dans cette vidéo, nous démontrons le test de décalage de mobilité électrophorétique pour détecter les interactions protéine-ADN à l’aide de sondes d’ADN marquées par fluorescence infrarouge. Lorsque la protéine se lie à la sonde d’ADN, elle forme un grand complexe qui migre lentement et apparaît comme une bande décalée sur le gel.

Protocole

1. Réaction de liaison et électrophorèse

1. Préparer 1 mL de tampon de liaison 5x en mélangeant 50 μL de 1 M de Tris-HCl, pH 7,5 ; 10 μL de 5 M NaCl ; 200 μL de 1 M de KCl, 5 μL de 1 M MgCl₂, 10 μL de 0,5 M EDTA, pH 8,0 ; 5 μL de 1 M DTT ; 25 μL de 10 mg/mL de BSA, et 695 μL de ddH₂O.
   note: Le tampon de liaison 5x peut être aliquote et stocké à -20 °C. Un autre point à considérer est que différents facteurs de transcription auront des modifications différentes du tampon de liaison.
2. Juste avant de mettre en place les réactions de liaison, pré-exécutez le gel de polyacrylamide natif à 5 % dans 0,5x TBE + 2,5 % de glycérol pour éliminer toutes les traces de persulfate d’ammonium à 80 V pendant 30 à 60 min, ou jusqu’à ce que le courant ne varie plus avec le temps.
3. Mettre en place la réaction de liaison dans le volume final de 20 μL.
   1. Mélangez 4 μL de tampon de liaison 5x, 80 à 200 ng de protéine A purifiée (dans 50 % de glycérol, c’est-à-dire SOX-2), 1 μL de sonde conjuguée à colorant 0,1 μM (concentration finale : 5 nM) et ddH₂O.
   2. Facultatif : Lorsque des concurrents de sonde froide sont nécessaires, ajoutez différentes concentrations (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) de sondes froides.
   3. Facultatif : Lorsque l’interaction entre les protéines A et B (c’est-à-dire SOX-2 et LIM-4) est testée, ajoutez 80 à 200 ng de protéine B purifiée (dans 50 % de glycérol, c’est-à-dire LIM-4).
   4. Facultatif : Lorsque la préparation d’un extrait nucléaire est utilisée et que la liaison spécifique de la protéine A doit être validée, ajouter un anticorps spécifique de la protéine A (c’est-à-dire anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
   5. Incuber à R/T dans l’obscurité pendant 15 min.
4. Chargez toutes les réactions de liaison sur le gel et faites fonctionner le gel à 10 V/cm jusqu’à la distance souhaitée.

2. Imagerie

REMARQUE : Le gel a été scanné directement dans les plaques de verre à l’aide d’un système d’imagerie infrarouge avancé. Par conséquent, le gel peut être résolu davantage et scanné à plusieurs reprises (figures 1C et 2). Un système d’imagerie fluorescente dans le proche infrarouge, principalement pour les transferts Western, a également été testé pour scanner le gel, mais seul le système d’imagerie infrarouge avancé a été capable de scanner le gel avec une bonne résolution. La méthodologie décrite est spécifique à un logiciel d’imagerie infrarouge particulier, bien que d’autres progiciels puissent être utilisés.

1. Nettoyez le lit du scanner avec du ddH₂O et séchez-le bien avant de numériser. Essuyez les plaques de verre du gel et placez les plaques contenant le gel sur le lit du scanner.
2. Ouvrez le logiciel d'imagerie infrarouge et allez dans l'onglet « Acquérir ». Lorsque la plaque la plus fine (1 mm) est placée sur le lit du scanner, utilisez les paramètres Canal : 700, Intensité : Auto, Résolution : 169 μm, Qualité : moyenne et Décalage de mise au point : 1,5 mm. Lorsque la plaque la plus épaisse (3 mm) est placée sur le lit du scanner, utilisez les paramètres Canal : 700, Intensité : Auto, Résolution : 84 μm, Qualité : moyenne et Décalage de mise au point : 3,5 mm. Le décalage de mise au point dépend de l’épaisseur de la plaque de verre.
3. Sélectionnez la zone occupée par le gel sur le scanner. Cliquez sur « Démarrer » pour commencer l'analyse.

Résultats

Graphique 1. fEMSA utilisant des oligonucléotides marqués à un colorant fluorescent infrarouge. (A) Organigramme de la fEMSA. (B) L’effet du colorant bleu de bromophénol, de l’orange G et du dI-dC (1 μg) sur la fEMSA. 5 nM de sonde 5'Dye-LIM-4/SOX-2 ont été utilisés. (C)fEMSA montrant une spécificité de liaison de 6xHis-SOX-2^G73E au site cible SOX-2 de l’élément LIM...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d’acrylamide/Bis à 30 %, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	L’acrylamide est nocif et toxique.
Albumine sérique bovine de qualité moléculaire	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	B9000S
Oligos d'ADN marqués 5' IRDye700	Technologies d’ADN intégrées	Oligo d’ADN personnalisé	Celles-ci sont appelées oligos d'ADN marqués au 5' ou marqués au colorant fluorescent infrarouge dans le manuscrit. La société synthétisera sur mesure des oligonucléotides d'ADN 5' marqués par IRDye. Nécessite une synthèse à l’échelle d’au moins 100 μM et une purification HPLC.
Cellule d’électrophorèse verticale Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658000FC	appareil
Système d’imagerie infrarouge Odyssey CLx	Biotechnologie LI-COR	Système d’imagerie infrarouge Odyssey CLx	appareil
Système d’imagerie Odyssey Fc	Biotechnologie LI-COR	Système d’imagerie bimode Odyssey Fc	appareil
Logiciel Image Studio (version 4.0)	Biotechnologie LI-COR	Logiciel Image Studio	logiciel
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G	chimique
6x Colorant de chargement orange			0,25 % d’orange g ; 30 % de glycérol
0,5x TBE			45 mM de tris-borate ; 1 mM d’EDTA
1x TE			10 mM de Tris-HCl ; 1 mM d’EDTA, pH 8,0
1x STE			100 mM NaCl ; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 1 mM EDTA
5x tampon de liaison			50 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM NaCl ; 200 mM KCl ; 5 mM MgCl2 ; 5 mM EDTA, pH 8,0 ; 5 mM DTT ; 250 ug/ml BSA