Immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines cibles sur l’ADN génomique

Résumé

Source : Dong, X., et.al., href="https://app.jove.com/v/57547">Identification des sites de liaison génomique du facteur de transcription Olig2 dans les cellules PDGFRα+ purifiées de manière aiguë par analyse de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine à faible cellule.J. Vis. Exp.(2018)

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines sur des régions spécifiques de l’ADN génomique des cellules précurseurs d’oligodendrocytes via l’immunoprécipitation sélective de fragments de chromatine liés aux protéines. Cette méthode permet d’étudier l’interaction de plusieurs protéines régulatrices, y compris les facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Purification de cellules de lignée oligodendrocytaire positives au PDGFRα à partir de cerveaux de souris (modifié à partir des protocoles d’immunopanning décrits précédemment)

1. Préparation d’une plaque d’immunopanning pour la sélection cellulaire positive de PDGFRα et de 2 plaques pour la déplétion des cellules endothéliales et de la microglie.
   note: Veuillez noter que les boîtes de Pétri mais pas les boîtes de culture cellulaire fonctionnent pour l’expérience d’immunopanning ; Si les cellules purifiées doivent être utilisées pour la culture, les étapes d’immunopannage doivent être effectuées dans l’enceinte de biosécurité
   1. Enduire une plaque de Petri de 10 cm d’IgG anti-rat de chèvre de 30 μL dans 10 mL de pH 9,5, 50 mM de Tris-HCl pendant une nuit à 4 °C. Agiter la plaque pour s’assurer que les surfaces des plaques sont uniformément et entièrement recouvertes par la solution de revêtement.
   2. Préparez une solution d'anticorps PDGFRα en diluant 40 μL d'anticorps anti-PDGFRα de rat avec 12 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco contenant 0,2 % de BSA.
   3. Après 3 lavages de la plaque revêtue d’IgG avec 10 mL de 1x DPBS chacune, incuber une plaque revêtue d’IgG avec une solution d’anticorps PDGFRα à température ambiante pendant 4 h.
   4. Laver la plaque recouverte d’anticorps anti-PDGFRα pour rat 3 fois avec 10 ml de 1x DPBS chacune. Ajoutez doucement la solution DPBS le long de la paroi latérale de la plaque et ne dérangez pas les surfaces revêtues.
   5. Enduire 2 nouvelles plaques de Petri de 15 cm pour l’épuisement des cellules endothéliales et de la microglie avec 20 mL de DPBS contenant 2,3 μg/mL de lectine 1 de Banderiaea simplicifolia (BSL-1) pendant 2 h.
   6. Lavez les plaques revêtues BSL-1 3 fois avec 20 mL 1x DPBS. Ajoutez doucement la solution DPBS le long de la paroi latérale des plaques et ne dérangez pas les surfaces revêtues.
2. La purification des cellules de lignée d’oligodendrocytes positifs au PDGFRα est modifiée par rapport aux méthodes publiées précédemment.
   1. Disséquer les tissus corticaux de 2 cerveaux de souris postnatals du jour 7 (P7) selon les protocoles précédemment publiés.
   2. Dissociez les tissus pour générer une suspension unicellulaire à l'aide d'un kit de dissociation du tissu neural (P) selon les instructions détaillées du fabricant.
   3. Coupez brièvement les tissus corticaux disséqués en morceaux à l’aide d’un scalpel et soumettez-les à une digestion enzymatique à 37 °C. Après la digestion, dissociez manuellement les morceaux avec des pipettes Pasteur en verre poli au feu en une suspension unicellulaire.
   4. Centrifuger la suspension unicellulaire à 300 x g pendant 10 min à température ambiante et suspendre la pastille cellulaire à l’aide de 15 mL de tampon d’immunopanning (le tampon d’immunopanning est du DPBS avec 0,02 % de BSA et 5 μg/mL d’insuline).
   5. Incuber la suspension unicellulaire de 2 cerveaux de souris de manière séquentielle sur 2 plaques revêtues de BSL-1 pendant 15 min à température ambiante avec une légère agitation de la plaque toutes les 5 min pour assurer une meilleure déplétion des cellules microgliales et endothéliales.
   6. Agitez doucement la plaque pour recueillir les cellules non adhérentes dans la suspension cellulaire et incubez-les sur la plaque recouverte d’anticorps anti-PDGFRα de rat pendant 45 min à température ambiante.
   7. Après l’incubation de la suspension cellulaire sur la plaque recouverte d’anticorps anti-PDGFRα de rat, faites tourner doucement la plaque pour recueillir la suspension cellulaire et rincez la plaque 8 fois avec du DPBS pour vous débarrasser des cellules non adhérentes. Ajoutez doucement la solution de lavage le long de la paroi latérale de la plaque et agitez la plaque plusieurs fois pour éliminer les cellules non adhérentes.
   8. Détachez les cellules de la plaque recouverte d’anticorps rat-PDGFRα à l’aide d’une solution de traitement de détachement cellulaire de 4 mL pendant 10 min à 37 °C. Agitez la plaque pour déloger les cellules adhérentes.
   9. Prélever les COP purifiés par centrifugation à 300 x g à température ambiante, suspendre la pastille cellulaire avec 2 mL de milieu de culture cellulaire OPC et compter les cellules à l’aide du bleu trypan et d’un hémocytomètre (500 mL de milieu de culture cellulaire dans un milieu DMEM/F12 contenant 5 mL de solution de pénicilline-streptomycine (P/S), 5 mL de N2, 10 mL de B27, 5 μg/mL d’insuline, 0,1 % de BSA, 20 ng/mL de bFGF et 10 ng/mL de PDGFRα).
3. Validation de la pureté des OPC après immunopannage.
   1. Afin d'évaluer l'enrichissement des OPC après immunopannage, utilisez une partie des OPC purifiés pour l'extraction de l'ARN avec une extraction à base de thiocyanate de guanidium selon les instructions du fabricant.
   2. Effectuer une qRT-PCR en utilisant un mélange maître de colorant vert fluorescent pour vérifier l’enrichissement de l’expression de PDGFRα dans les OPC purifiés par rapport aux cellules cérébrales dissociées selon les matériaux précédemment publiés.
   3. De plus, ensemencez des OPC purifiés dans les plaques à 24 puits recouvertes de Poly-D-Lysine pour l’immunomarquage avec un anticorps anti-NG2 de sulfate de chondroïtine protéoglycane (NG2) en tant que matériaux précédemment publiés.

2. Préparation de ChIP à faible cellule et construction de bibliothèques ChIP pour le séquençage à haut débit

1. Préparation de la ChIP à faible nombre de cellules Olig2 avec un système de sonication disponible dans le commerce et un kit ChIP à faible nombre de cellules disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) en suivant les procédures standard détaillées des instructions du fabricant.
   1. Après s’être détaché de la plaque recouverte d’anticorps anti-PDGFRα de rat et avoir compté les cellules avec du bleu de trypan et un hémocytomètre, placez 20 000 OPC purifiés dans 1 mL de milieu de culture cellulaire OPC pour chaque réaction ChIP.
   2. Ajouter 27 μL de formaldéhyde à 36,5 % pour fixer la suspension cellulaire pendant 10 min à température ambiante.
      prudence: Veuillez noter que le formaldéhyde doit être utilisé dans la hotte chimique pour des raisons de sécurité.
   3. Arrêter la réticulation ADN-protéine avec 50 μL 2,5 M de glycine pendant 5 min à température ambiante.
      note: Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace ou dans une chambre froide à 4 °C à partir de ce point.
   4. Lavez les granules de cellules réticulées avec 1 mL de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) glacée avec cocktail d'inhibiteurs de protéase et obtenez les cellules granulées par une centrifugeuse pré-refroidie à 300 x g à 4 °C.
   5. Lyser la pastille cellulaire dans un tampon de lyse complet de 25 μL pendant 5 min sur ice.
      note: Agitez le tube pour suspendre les cellules dans le tampon de lyse.
   6. Complétez le lysat cellulaire avec 75 μL de HBSS glacé contenant un cocktail inhibiteur de protéase et cisaillez la chromatine du lysat cellulaire par un système de sonication pré-refroidi avec 5 cycles de 30 s ON et 30 s de programme OFF. Assemblez toujours 6 tubes et assurez-vous que les tubes d’équilibre contiennent 100 μL d’eau.
   7. Après cisaillement, centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube après centrifugation.
   8. Diluez 100 μL de chromatine cisaillée avec un volume égal de tampon ChIP complet glacé avec l’inhibiteur de protéase.
   9. Enregistrez 20 μL de chromatine cisaillée diluée comme échantillon de contrôle d’entrée.
      note: Un échantillon de contrôle d’entrée est également nécessaire pour la comparaison avec l’échantillon immunoprécipité d’Olig2 afin d’identifier l’ADN immunoprécipité de l’anticorps d’Olig2.
   10. Ajouter 1 μL d’anticorps anti-olig2 de lapin à 180 μL de chromatine cisaillée diluée et incuber le tube de réaction sur une roue rotative à 40 tr/min pendant 16 h à 4 °C
       note: Effectuez cette étape dans une chambre froide.
   11. Pour chaque réaction ChIP, laver 11 μL de billes recouvertes de protéine A magnétique avec 55 μL de tampon de lavage de billes et mettre la pastille de bille dans 11 μL de tampon de lavage de billes après 2 lavages.
       note: Effectuez cette étape dans une chambre froide.
   12. Pour chaque réaction ChIP, ajoutez 10 μL de billes enrobées de protéine A prélavées dans le tube de réaction ChIP. Effectuez cette étape dans une chambre froide.
   13. Incuber le tube de réaction ChIP à 4 °C pendant encore 2 h sur une roue rotative.
   14. Placez le tube de réaction ChIP sur la grille magnétique pendant 1 min.
       note: Effectuez cette étape dans une chambre froide.
   15. Retirez le surnageant et ne délogez pas la pastille de bille.
   16. Lavez la pastille de billes avec 100 μL pour chacun des 4 tampons de lavage pendant 4 min sur une roue rotative à 4 °C.
   17. Après les lavages, ajoutez 200 μL de tampon d’élution à la pastille de bille et incubez le tube réactionnel ChIP à 65 °C pendant 4 h pour inverser la réticulation protéine-ADN.
   18. De plus, ajoutez 180 μL de tampon d’élution à 20 μL d’échantillon de contrôle d’entrée et incubez à 65 °C pendant 4 h pour inverser également la réticulation protéine-ADN.
   19. Ajouter 200 μL 25:24:1 (v/v) d’un mélange de phénol, de chloroforme et d’alcool isoamylique dans chaque tube réactionnel ChIP.
   20. Agiter vigoureusement pendant 1 min et centrifuger à 13 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Transférez la phase supérieure dans un nouveau tube.
   21. Ajouter 40 μL de solution d’acétate de sodium 3M, 1 000 μL d’éthanol à 100 % et 2 μL de précipitant de glycogène lié de manière covalente à un colorant bleu dans chaque tube réactionnel ChIP pendant une nuit à -20 °C.
   22. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
   23. Jetez le surnageant, lavez-le avec 500 μL d’éthanol à froid à 70 % et centrifugez-le à 13 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
   24. Jetez le surnageant, gardez le granulé à l’air sec pendant 10 min et dissolvez le granulé avec 50 μL d’eau.
2. Construction de bibliothèques ChIP pour le séquençage à haut débit
   1. Nettoyez et concentrez l'ADN ChIP à l'aide d'un kit de nettoyage selon les instructions du fabricant.
   2. Quantifier l'échantillon ChIP avec un pico-vert selon les instructions du fabricant.
   3. Utilisez un kit ChIP-seq pour le T-tailing, la réplication et le tailing, la commutation et l'extension de modèles, l'ajout d'adaptateurs et d'amplification, la sélection de la taille de la bibliothèque et la purification selon les instructions du fabricant.
      1. Après la dénaturation de l'ADNdb, déphosphoryler l'extrémité 3' de l'ADNss par la phosphatase alcaline de la crevette et ajouter une queue poly (T) à l'ADNss par la désoxynucléotidyltransférase terminale.
      2. Recuit l’amorce d’ADN poly (dA) sur le modèle d’ADNss pour la réplication de l’ADN et le changement de modèle.
      3. Après le changement de modèle, amplifiez la bibliothèque ChIP-seq par PCR avec les amorces avant et arrière pour l’indexation.
      4. Sélectionnez la bibliothèque ChIP-seq amplifiée par PCR avec des fragments allant de 250 à 500 pb par billes paramagnétiques avec l’option 2 pour une sélection de taille double.
      5. Examinez la qualité de la bibliothèque ChIP-seq sélectionnée à l’aide d’un dispositif d’électrophorèse microfluidique par puce capillaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif / Équipement
Banderiaea simplicifolia lectine 1	Laboratoires Vecteurs	# L-1100
Anticorps anti-PDGFRa chez le rat	BD Biosciences	# 558774
Kit de dissociation du tissu neural (P)	MACS Miltenyi Biotec	# 130-092-628
Accutase	Technologies STEMCELL	# 07920
TRIzol	Thermo Fisher	# 15596026
Anticorps anti-NG2 Chondroïtine Sulfate Protéoglycane	Millipore	# AB5320
Bioruptor Pico sonication device	Diagenode	# B01060001
Kit True MicroChIP	Diagenode	# C01010130
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1, v/v)	Thermo Fisher	# 15593031
NucleoSpin Gel et kit de nettoyage PCR	MACHEREY-NAGEL	# 740609
Kit de dosage d’ADNdb Quant-iT PicoGreen	Thermo Fisher	# P11496
Kit DNA SMART ChIP-Seq	Laboratoires Clontech	# 634865
Agencourt AMPure XP	Beckman Voulter	# A63880
GlycoBlue	Thermo Fisher	# AM9516
Pico-vert	Thermo Fisher	# P11496
D-PBS	Thermo Fisher	# 14190-144
SYBR Green master mix	Laboratoires Bio-Rad	# 1725124
DMEM/F12	Fisher Scientific	# 11-320-033
Pénicilline-streptomycine (P/S)	Fisher Scientific	# 15140122
N-2 Supplément	Fisher Scientific	# 17502048
B-27 Supplément	Fisher Scientific	# 17504044
insuline	sigma	# I6634	Préparez une solution d’insuline à 0,5 mg/ml en dissolvant 5 mg d’insuline dans 10 ml d’eau et 50 μl de HCl 1 N.
Albumine sérique bovine, adaptée à la culture cellulaire (BSA)	sigma	# A4161	Préparez une solution de BSA à 4 % en dissolvant 4 g de BSA dans 100 ml de D-PBS et ajustez le pH à 7,4
Protéine basique du facteur de croissance des fibroblastes, recombinante humaine (bFGF)	EMD Millipore	# GF003
HUMAIN PDGF-AA	VWR	# 102061-188
Poly-D-lysine	VWR	# IC15017510	Préparez une solution de poly-D-lysine à 1 mg/ml en dissolvant 10 mg de poly-D-lysine dans 10 ml d’eau et diluez 100 fois lors de l’utilisation.
Boîtes de Pétri jetables Falcon, stériles, Corning, 100x15mm	VWR	# 25373-100
Boîtes de Pétri jetables Falcon, stériles, Corning, 150x15mm	VWR	# 25373-187
HBSS, 10X, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol	Fisher Scientific	# 14185-052
Bleu trypan	Technologies des cellules souches	# 07050
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	sigma	# 11697498001
Noms d’amorce utilisés pour la qPCR			Séquences d’amorces utilisées pour la qPCR
MBP-F :			CTATAAATCGGCTCACAAGG
MBP-R :			AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F :			ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R :			GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F :			GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R :			TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-F			ATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-R			CATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-F			TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-R			GATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-F			AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-R			GTCCCTCCACGGTACTCCT