1. Microscopie à polarisation
- Pour l’éclairage laser à grand champ, focalisez une ligne de 638 nm d’un laser à diode continue (40 mW) sur l’ouverture d’une fibre optique multimode pour le nettoyage du faisceau. Montez un polariseur linéaire à la sortie de la fibre pour régler la polarisation de la lumière laser.
- Bloquez la composante d’excitation de la lumière émise à l’aide d’un miroir dichroïque (coupure 640 nm) et d’un filtre passe-bande (passe-bande 700/75).
- Laissez le signal de fluorescence passer à travers un séparateur de faisceau polarisant, qui divise la lumière émise en ses composantes polarisées perpendiculaires et parallèles. Ensuite, focalisez le faisceau non réfléchi (composante parallèle) et le faisceau réfléchi (composante perpendiculaire) avec une lentille achromatique de 200 mm de distance focale sur la puce d’une caméra EM-CCD rétroéclairée (Figure 1b et 1c). Utilisez un miroir pour ajuster la direction du faisceau perpendiculaire vers l’objectif.
2. Conception et test d’un oligomère d’ADN de référence marqué par fluorescence
- Déterminer la séquence centrale de l’ADN de référence : la méthode est basée sur un test compétitif qui mesure la constante de dissociation (KD2) entre un facteur de transcription et un oligomère d’ADN concurrent non marqué qui entre en compétition pour la liaison avec un ADN marqué par fluorescence dont l’affinité pour le TF fait office de référence (KD1). La séquence consensus obtenue à partir d’autres sources comme l’empreinte DNase ou le 1-hybride bactérien peut servir de point de départ.
note: En règle générale, un ADN de référence approprié présente une diminution de 3 à 7 fois de l’affinité de liaison au TF par rapport à la séquence consensus.
- Mesurer par HiP-FA les KD1s de 2-3 mutations uniques provisoires de la séquence consensus dérivée à l’étape précédente. Essayez de modifier les positions dans des séquences de consensus qui ne sont pas trop spécifiques pour éviter la perte complète de binding.
note: Il est important que la séquence de référence soit liée par le facteur de transcription d’intérêt (nous avons utilisé dans ce protocole Giant Gt), mais pas trop fortement, afin que des concurrents plus faibles puissent la surpasser à des concentrations élevées.
- Étendez le motif central (8 à 12 paires de bases généralement) à une longueur de 16 paires de bases ou plus en ajoutant une séquence de flanquement symétrique des deux côtés (ajoutez des chaînes latérales pour une bonne reliure). Si nécessaire (pour les domaines de liaison plus longs, par exemple), utilisez des séquences plus longues (jusqu’à ~50 paires de bases de longueur ont été testées avec le test HiP-FA).
prudence: Attention à ne pas ajouter de bases qui sont censées créer des sites de liaison ectopiques. Utilisez des outils informatiques qui prédisent les sites de liaison à partir des PWM disponibles pour faciliter ce processus (par exemple, PySite).
- En tant qu'ADN de référence marqué, commandez des oligomères qui sont marqués par fluorescence sur le brin avant ou arrière à l'extrémité 3' ou 5'. Utiliser, par exemple, Cy5, Bodipy-650 ou tout autre colorant approprié à une concentration de 10 μM (100 μM 10x stock) dans l’eau, et diluer par étapes comme décrit à l’étape 3.1.
- Préparez 500 ml de 1x tampon de liaison en ajoutant 33 mM de tampon de phosphate de potassium (pH = 7,0), 90 mM de NaCl et 0,01 % de détergent non ionique dans de l’eau distillée. Préparez également un tampon de liaison 3x, qui contient les mêmes composants, sauf à des concentrations triples. Si vous utilisez le tampon de liaison 3x comme solution mère pour le tampon de liaison 1x, préparer des volumes > 500 mL ; sinon, préparer 250 mL.
note: Cette composition a été optimisée pour la stabilité du facteur de transcription et pour prévenir la dimérisation de la glutathion S-transférase (GST).
- Mesurer, à l’aide de la configuration de microscopie décrite à l’étape 1, l’AF de 200 μL de tampon de liaison contenant de l’ADN de référence marqué à 0,8 nM en présence de différentes quantités de TF dans une plaque de microscopie à fond de verre à 96 puits (5-6 puits avec différentes concentrations de TF) pour déterminer la concentration de TF à utiliser. Effectuez une série de titrages avec des quantités croissantes de TF et choisissez pour le dosage la concentration pour laquelle la courbe atteint un plateau, indiquant une liaison complète de l’oligomère de référence de l’ADN.
note: La concentration optimale de TF dépend des valeurs des constantes de dissociation TF-ADN. En général, des concentrationsplus faibles nécessitent des concentrations plus faibles.
3. Recuit des oligomères
- Pour recuire les oligomères d’ADN de l’ADN de référence marqué (séquence déterminée à l’étape précédente), mélangez 7 μL d’une solution d’ADN simple brin avant marquée à un colorant de 10 mM et 7 μL d’une concentration de 10 mM de son complément inverse non marqué dans 186 μL d’eau.
- Pour les séquences d’ADN concurrentes, mélanger 20 μL de solutions de 100 mM (dans de l’eau, fournies par le fabricant) d’ADN simple brin direct avec 20 μL de 100 mM d’ADN simple brin inverse correspondant pour chaque séquence concurrente individuelle à mesurer.
- Effectuez le recuit séparément dans un cycleur PCR standard en chauffant les solutions à 70 °C pendant 3 min et en diminuant la température à RT à une vitesse de 0,1 K/s. Si l’appareil de PCR utilisé ne supporte pas les gradients de température à ce taux, il suffit d’effectuer des incubations par étapes avec des températures décroissantes (testées étaient 99 cycles de 3 s avec -0,4 K par cycle).
4. Préparation du gel
REMARQUE : La section suivante explique la préparation de deux types de gels différents : 1) les puits de titrage contiennent des gels contenant des protéines et sont utilisés pour déterminer les KDs pour les séquences d’ADN concurrentes respectives, et 2) les puits d’étalonnage utilisent NB pour déterminer la concentration d’ADN à chaque point temporel et à chaque hauteur d’acquisition donnés. L’accent est mis sur la préparation de l’expérience dans une plaque de 96 puits, mais les volumes correspondants pour un format de plaque de 384 puits sont également indiqués.
- Dissoudre l’agarose à bas point de fusion à 0,5 % p/v dans le tampon de liaison en le faisant bouillir dans un four à micro-ondes de laboratoire. Après la dissolution complète, ajustez à nouveau le volume avec ddH2O pour compenser une éventuelle évaporation.
note: Pour plus de commodité, préparez un stock de 10 à 20 10 mL d’aliquotes de gels et faites-les fondre à 75 °C au besoin. Les stocks de gel peuvent être stockés chez RT.
prudence: Veillez à ne pas surchauffer la solution de gel dans le four à micro-ondes. Des intervalles de chauffage courts avec agitation entre les deux sont préférables.
- Pour préparer les puits de titrage et d’étalonnage, faites d’abord fondre deux aliquotes de gel de 10 mL à 75 °C en agitant.
- Utilisez 240 μL (y compris 20 % de surcharge) pour chaque concurrent (n = nombre de séquences de compétiteurs).
- Utilisez le même volume de gel pour le bien calibrage NB afin d’assurer une température et une viscosité égales des deux gels.
- Réglez ensuite la température à 35 °C et attendez que la température s’équilibre.
- Pour les puits de titrage, ajouter de l’ADN de référence hybridé de 1,4 nM (concentration finale) (obtenu à l’étape 3), de la protéine TF (concentration finale CTF = 20-60 nM, déterminée à l’étape 2.6), du DTT (0,2 mM) et du tampon de liaison dans un volume total de n x 200 μL ou n x 13 μL dans un format de plaque à 96 ou 384 puits, respectivement (plus les frais généraux). Mélangez soigneusement en inversant/secouant (ne pas vortex).
- Ajouter lentement 200 μL par puits dans un format de plaque à 96 puits (13 μL/puits pour 386 puits) de la solution de gel préparée à l’étape précédente dans les puits de titrage de la plaque de puits.
- Pour les puits d’étalonnage, ajoutez d’abord 5 nM NB au gel fondu à l’extérieur des puits (le volume total dépend du format de la plaque de puits utilisée et du nombre de puits d’étalonnage ; généralement 5 à 6 par plaque de puits suffisent).
- Pipetez lentement 200 μL (13 μL pour le format de plaque à 384 puits) de gel contenant du NB dans les puits de titrage de la plaque à puits et assurez-vous d’éviter les bulles d’air.
note: L’utilisation de pipettes électroniques ou de robotique augmente considérablement la reproductibilité.
- Laissez le gel se solidifier pendant 10 min à RT, et encore 10 min à 4 °C (retirez la condensation du verre par la suite si nécessaire). Assurez-vous d’effectuer toutes ces étapes sur une surface parfaitement horizontale pour éviter les surfaces de gel non homogènes.
note: Les gels contenant des protéines sont généralement stables pendant au moins plusieurs heures à 4 °C.
5. Ajout de la solution ADN concurrente
REMARQUE : Les solutions suivantes doivent être préparées avant de commencer le titrage et être ajoutées simultanément au-dessus des puits d’étalonnage et de titrage.
- Ajouter l’ADN et la protéine de référence marqués recuits dans un tampon de liaison 3x à des concentrations 3 fois plus élevées que les aliquotes de gel.
- Mélanger 20 μL de la solution obtenue avec 40 μL de chaque solution d’ADN concurrent recuite obtenue à l’étape 3.
- Pour chaque puits d’étalonnage, mélanger 20 μL de tampon de liaison 3x contenant 15 mM de solution NB avec 40 μL d’ADN concurrent recuit (toute séquence de même longueur convient).
note: Pour les plaques à 384 puits, utilisez 21 μL au lieu de 60 μL au total.
- En option, vérifiez l’homogénéité des niveaux de hauteur de gel dans les différents puits de la plaque par spectroscopie en mesurant l’absorbance à 380 nm, à l’aide d’un lecteur de plaques multi-puits (les valeurs d’absorbance sont proportionnelles aux hauteurs de gel).
- Ajoutez 50 μL (7 μL pour le format de plaque à 384 puits) des solutions d’ADN concurrentes mélangées (recuites à l’étape 3) sur les gels. Essayez d’ajouter toutes les solutions concurrentes aussi simultanément que possible en utilisant des pipettes électroniques multicanaux ou une tête de pipetage à 96 canaux, si disponible. Après l’ajout des solutions concurrentes, placez la plaque sur la platine du microscope et commencez immédiatement les mesures.
6. Acquisition d’images
- Acquérir séquentiellement des séries chronologiques de piles z (par exemple, utiliser 12 plans et 100 à 300 ms de temps d’éclairage). Évitez de prendre des images trop près de la surface du puits (< ~1,4 μm avec les plaques utilisées ici) pour exclure tout biais de polarisation.
- Effectuez 10 à 25 cycles de mesures jusqu’à la déliaison complète de l’ADN de référence marqué du TF. Le point final est généralement atteint après 1 à 2 h, en fonction de la cinétique de liaison et de la diffusivité de l’ADN concurrent.
