1. Préparation du système
- Conception de plasmides de site de liaison
- Concevez la cassette du site de reliure comme illustré à la figure 1. Chaque minigène contient les parties suivantes (5' à 3') : site de restriction Eagl, ∼40 bases de l'extrémité 5' du gène de résistance à la kanamycine (Kan), promoteur de pLac-Ara, site de liaison aux ribosomes (RBS), AUG du gène mCherry, un espaceur (δ), un site de liaison RBP, 80 bases de l'extrémité 5' du gène mCherry, et une restriction ApaLI site.
note: Pour augmenter le taux de réussite de l’essai, concevez trois cassettes de site de liaison pour chaque site de liaison, avec des espaceurs composés d’au moins une, deux et trois bases. Consultez la section Résultats représentatifs pour plus de directives.
- Clonage de plasmides de sites de liaison
- Commandez les cassettes du site de liaison en tant que minigènes d’ADN double brin (ADNdb). Chaque minigène mesure ∼500 pb de long et contient un site de restriction Eagl et un site de restriction ApaLI aux extrémités 5' et 3', respectivement (voir étape 1.1.1).
note: Dans cette expérience, des mini-gènes contenant la moitié du gène de la kanamycine ont été commandés pour faciliter le dépistage des colonies positives. Cependant, l’assemblage Gibson convient également ici, auquel cas le site de liaison peut être ordonné comme deux oligos d’ADN simple brin complémentaires plus courts.
- Double-digérer à la fois les mini-gènes et le vecteur cible avec Eagl-HF et ApaLI par le protocole de restriction, et purifier la colonne.
- Ligaturez les minigènes digérés vers le squelette du site de liaison contenant le reste du gène rapporteur mCherry, le terminateur et un gène de résistance à la kanamycine.
- Transformez la solution de ligature en cellules Escherichia coli TOP10.
- Identifier les transformants positifs via le séquençage de Sanger.
- Concevez une amorce 100 bases en amont de la région d’intérêt (voir le tableau 1 pour les séquences d’amorces).
- Miniprep quelques colonies bactériennes.
- Préparez 5 μL d’une solution de 5 mM de l’amorce et 10 μL d’ADN à une concentration de 80 ng/μL.
- Envoyez les deux solutions à un établissement pratique pour le séquençage de Sanger.
- Stockez les plasmides purifiés à -20 °C et les souches bactériennes sous forme de stocks de glycérol, tous deux au format 96 puits. L’ADN sera ensuite utilisé pour la transformation en cellules TOP10 d’E. coli contenant l’un des quatre plasmides RBP de fusion (voir l’étape 1.3.5).
- Conception et construction du plasmide RBP
REMARQUE : Les séquences d’acides aminés et de nucléotides des protéines d’enveloppe utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 2.
- Commandez la séquence RBP requise sans codon stop en tant que minigène d’ADNdb ordonné sur mesure sans codon stop avec des sites de restriction aux extrémités (Figure 1).
- Clonez la RBP testée dépourvue de codon stop immédiatement en aval d’un promoteur inductible et en amont d’une protéine fluorescente dépourvue de codon de départ (Figure 1), comme aux étapes 1.2.2 à 1.2.4. Assurez-vous que le plasmide RBP contient un gène de résistance aux antibiotiques différent de celui du plasmide du site de liaison.
- Identifier les transformants positifs par séquençage de Sanger, comme à l’étape 1.2.5 (voir le tableau 1 pour les séquences d’amorces).
- Choisissez un transformant positif et rendez-le chimiquement compétent. Stocker sous forme de glycérol les plasmides purifiés à -20 °C et les stocks de glycérol des souches bactériennes à -80 °C dans des plaques à 96 puits.
- Transformer les plasmides du site de liaison (à partir de l’étape 1.2.6) stockés dans des plaques de 96 puits en cellules bactériennes chimiquement compétentes contenant déjà un plasmide RBP-mCerulean. Pour gagner du temps, au lieu de placer les cellules sur des boîtes de Pétri, placez-les à l’aide d’une pipette à 8 canaux sur des plaques à 8 voies contenant de la gélose Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés (Kan et Amp). Les colonies devraient apparaître dans 16 h.
- Sélectionnez une seule colonie pour chaque transformant double et cultivez pendant la nuit dans un milieu LB avec les antibiotiques appropriés (Kan et Amp) et stockez-les sous forme de stocks de glycérol à -80 °C dans des plaques à 96 puits.
2. Configuration de l’expérience
REMARQUE : Le protocole présenté ici a été réalisé à l’aide d’un système robotisé de manipulation de liquides en combinaison avec un incubateur et un lecteur de plaques. Chaque mesure a été effectuée pour 24 concentrations d’inducteurs, avec deux duplicatas pour chaque combinaison souche + inducteur. À l’aide de ce système robotisé, des données pour 16 souches par jour avec 24 concentrations d’inducteurs ont été recueillies. Cependant, si un tel dispositif n’est pas disponible, ou si moins d’expériences sont nécessaires, celles-ci peuvent facilement être réalisées à la main à l’aide d’une multipipette à 8 canaux et en adaptant le protocole en conséquence. Par exemple, des résultats préliminaires pour quatre souches par jour avec 12 concentrations d’inducteurs et quatre points temporels ont été obtenus de cette manière.
- Préparez à l’avance 1 L de tampon d’essai biologique (BA) en mélangeant 0,5 g de tryptone, 0,3 mL de glycérol, 5,8 g de NaCl, 50 mL de 1 M de MgSO4, 1 mL de tampon salin tamponné au phosphate (PBS) 10x pH 7,4 et 950 mL d’eau distillée double (DDW). Filtre autoclave ou stérile le tampon BA.
- Cultiver les souches à double transformant à 37 °C et à 250 tr/min en agitant dans 1,5 mL LB avec des antibiotiques appropriés (kanamycine à une concentration finale de 25 μg/mL et ampicilline à une concentration finale de 100 μg/mL), dans des plaques de 48 puits, sur une période de 18 h (toute la nuit).
- Le matin, faites les préparations suivantes.
- Plaque d’induction. Dans une plaque propre à 96 puits, préparer des puits avec un milieu semi-pauvre (SPM) composé de 95 % de BA et de 5 % de LB26 dans l’incubateur à 37 °C. Le nombre de puits correspond au nombre souhaité de concentrations d’inducteurs. Ajouter du C4-HSL dans les puits de la plaque d’inducteur qui contiendra la concentration d’inducteur la plus élevée (218 nM).
- Programmez le robot pour diluer en série le milieu de chacun des puits les plus concentrés en 23 concentrations inférieures allant de 0 à 218 nM. Le volume de chaque dilution de l’inducteur doit être suffisant pour toutes les souches (y compris les doublons).
- Pendant la préparation des dilutions de l’inducteur, réchauffer 180 μL de SPM dans l’incubateur à 37 °C, dans des plaques à 96 puits.
- Diluer les souches nocturnes de l’étape 2.2 d’un facteur 100 par dilutions en série : diluer d’abord par un facteur 10 en mélangeant 100 μL de bactéries avec 900 μL de SPM dans des plaques à 48 puits, puis diluer à nouveau par un facteur 10 en prélevant 20 μL de la solution diluée dans 180 μL de SPM préchauffé, en plaques à 96 puits adaptées aux mesures fluorescentes.
- Ajouter l’inducteur dilué de la plaque d’inducteur aux plaques à 96 puits avec les souches diluées en fonction des concentrations finales.
- Agitez les plaques à 96 puits à 37 °C pendant 6 h, tout en prenant des mesures de densité optique à 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) et mCerulean (460 nm/510 nm) via un lecteur de plaques toutes les 30 min. À des fins de normalisation, mesurez la croissance de la SMP sans ajout de cellules.
