1. Jour 9 (matin) : Démarrer la culture pour la mesure enzymatique.
- Remettre en suspension la culture et transférer 125 μL à l’aide d’une pipette multicanaux sur une plaque de spectrophotomètre (mesureOD 600).
note: Attention : Ne distribuez pas la dernière goutte pour éviter les bulles, si le OD600 est inférieur à 0,3 - 0,6, incubez les cellules restantes pendant 1 à 2 h de plus en fonction de la lecture. La culture de 125 μL utilisée à cette étape peut être jetée ou transférée dans le bloc de puits profond d'origine à la discrétion de l'utilisateur.
- Centrifuger les cellules restantes dans le bloc de puits profond pendant 10 min à 3000 x g et 21 °C. Éliminer le surnageant en l’inversant.
- Ajouter 200 μL de Z-buffer et vortex.
note: Veuillez consulter la recette du Z-buffer dans le Tableau 1.
- Centrifuger pendant 5 min à 3000 x g et 21 °C. Éliminer le surnageant en l’inversant.
- Ajouter 20 μL de tampon Z et vortex.
- Recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité qui peut résister aux cycles de gel-dégel. Effectuez 4 cycles de congélation/décongélation en utilisant de l’azote liquide dans une hotte, puis 42 ºC dans un bain-marie (2 min chacun).
- Ajouter 200 μL de tampon Z/bêta-mercaptoéthanol (β-ME)/Ortho-nitrophényl-β-galactoside (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8,4 mg respectivement donnera une solution de 20 mL ; toujours préparer frais).
note: L’ONPG mettra un certain temps à se dissoudre correctement, alors préparez la solution une heure avant d’atteindre cette étape. L’ONPG sert de substrat pour la mesure de l’activité de la β-galactosidase.
- Incuber jusqu’à 17 à 24 h à 30 °C (vérifiez entre les deux, si la couleur se développe plus tôt, passez à l’étape suivante).
2. Jour 10 (matin) : Arrêtez la réaction et mesurez.
- Ajouter 110 μL 1M Na2CO3 pour arrêter la réaction et enregistrer le temps.
- Vortex et centrifugeuse pendant 10 min à 3000 x g et 21 °C.
- Prélever 125 μL de surnageant à l’aide du multicanal et mesurer la DO420,
note: Attention, ne versez pas la dernière goutte pour éviter les bulles.
Tableau 1 : Recette des solutions utilisées dans le protocole. Le tableau fournit la recette des solutions mères et de travail des principaux tampons utilisés dans l’essai.
| Tampon TE 10X (10ml) | |
| souhaitable | À partir du stock |
| 1000mM Tris-Cl (pH 8.0) | 1mL de Tris 1M |
| 10 mM d’EDTA (pH 8,0) | 200uL d’EDTA 0.5M |
| Compléter le volume avec de l’eau | |
| TE/LiAc (10ml) | |
| souhaitable | À partir du stock |
| 1 fois | 1 ml TE 10X |
| 0,1 M LiAc | 1mL LiAc 1M |
| Compléter le volume avec de l’eau | |
| TE/LiAc/PEG (50 ml) 50 % | |
| souhaitable | À partir du stock |
| 1 fois | 5 mL TE 10X |
| 0,1 M LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 ml PEG3350 | |
| Tampon Z (1L) pH 7,0 | |
| Na2HPO4 16,1g d’heptahydraté ou 8,52g d’anhydre |
| NaH2PO4 5,5g d’hydraté ou 4g d’anhydre |
| KCl 0.75g |
| MgSO4 0,246g d’hydraté ou 0,12g d’anhydre |
| Maintenir le pH avec HCl |
| Toutes les solutions sont stérilisées avant utilisation. |
| Milieux et plaques de gélose utilisés dans le protocole (YPDA, SD-Ura ; Plaques de gélose SD-Trp-Ura et SD-Trp-Ura) suivent la même recette qu’en Y1H |
