1. Préparation des protéines
- Constructions d’expression MOV10
- Générer des constructions d’expression d’ADNc codant pour MOV10 de souris.
- Configurez les réactions d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) pour chaque fragment. Mélangez 1 μL d’ADNc de souris (à partir de testicules de souris C57BL/6), 1 μL de dNTP, 2 μL d’amorce directe 10 μM, 2 μL d’amorce inverse 10 μM, 1 μL d’ADN polymérase, 25 μL de tampon PCR 2x et 18 μL de H2O (ddH2O) doublement distillé dans un volume final de 50 μL.
note: Les amorces pour l’amplification des fragments du gène Mov10 sont énumérées dans le tableau 1.
- Effectuez des réactions PCR à l’aide des programmes suivants : 95 °C pendant 5 min, 35 cycles de chauffage à 95 °C pendant 15 s, recuit à 64 °C pendant 15 s, extension à 72 °C pendant 20 s (2 min pour l’extension MOV10 sur toute la longueur) et extension finale à 68 °C pendant 7 min.
- Analysez l’ADN PCR amplifié par électrophorèse sur gel, coupez rapidement la bande de la taille requise du gel sous une lampe UV et placez-la dans un tube à centrifuger.
note: La taille de produit attendue visible sur le gel d’agarose pour MOV10 est de 3015 pb.
- Purifiez l'ADN PCR à l'aide d'un kit d'extraction de gel en suivant le protocole du fabricant.
- Ajoutez un volume égal de tampon de dissolution dans le tube de centrifugation à partir de l’étape 1.1.2 et faites fondre le gel dans un bain-marie à 50-55 °C pendant 5 à 10 min, en veillant à ce que les morceaux de gel fondent complètement. Centrifugez brièvement pour recueillir les gouttelettes de la paroi du tube.
note: La concentration massique/volumique du gel et du tampon dissolvant est de 1 mg/μL.
- Placez la colonne d’adsorption dans le tube de prélèvement, transférez la solution contenant le fragment de gel dissous dans la colonne d’adsorption et centrifugez à 12 000 x g pendant 2 min.
- Jetez le filtrat au fond des tubes de collecte. Ajouter 600 μL de tampon de lavage dans la colonne, centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min et jeter le filtrat.
- Répétez l’étape 1.1.3.3 une fois.
- Remettez la colonne dans le tube de collecte et centrifugez à 12 000 x g pendant 2 min pour éliminer tout le tampon de lavage restant.
- Placez la colonne d’adsorption dans un tube à centrifuger stérilisé de 1,5 ml, ajoutez 50 μL de ddH2O au centre de la colonne d’adsorption et centrifugez à 12 000 x g pendant 1 min. Mesurez la concentration d’ADN de l’éluat à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Digestion par restriction des plasmides
- Digérer le vecteur pRK5 avec BamHI et XhoI en mélangeant 4 μg de vecteur pRK5, 5 μL de tampon de digestion 10x, 1 μL de BamHI et 1 μL de XhoI et ddH2O jusqu’à un volume de réaction final de 50 μL. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
- Analysez l’ADN du vecteur par électrophorèse sur gel, coupez rapidement la bande de taille souhaitée du gel avec un scalpel sous une lampe UV et placez-la dans un tube à centrifuger.
- Purifier l'ADN du vecteur avec un kit d'extraction de gel comme 1.1.3 en suivant les instructions du fabricant.
- Mettre en place une réaction de ligature recombinante standard en combinant 0,03 pmol de vecteur linéarisé, 0,06 pmol de fragment d’ADNc, 2 μL de ligase et 4 μL de tampon 5x ligase et de ddH2O dans un volume de réaction final de 10 μL.
note: Clonez MOV10 dans un vecteur pRK5.
- Incuber le mélange à 37 °C pendant 30 min, puis refroidir immédiatement la réaction pendant 5 min sur de la glace. Transformer les plasmides recombinants MOV10 en bactéries DH5α.
note: Vérifier toutes les constructions recombinantes par séquençage de Sanger.
- Préparez des stocks de glycérol de cultures bactériennes contenant des plasmides recombinants vérifiés en ajoutant un volume égal de glycérol à 50 % aux cultures liquides et en les stockant à -80 °C.
note: Pour chaque expérience subséquente, étalez des bactéries des stocks de glycérol sur une plaque de gélose fraîche et utilisez une seule colonie pour l’expansion, comme décrit à l’étape 1.2.
- Extraits de protéines MOV10 à partir de cellules HEK293T
- Exprimer transitoirement les protéines MOV10 dans les cellules HEK293T en culture.
- Préparez le plasmide MOV10-pRK5 à une concentration de >500 ng/μL.
- Semez HEK293T cellules dans des boîtes de 15 cm. Lorsque la densité cellulaire atteint ~70 % à 90 %, remplacez le milieu de culture cellulaire par du milieu frais Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
- Pour une transfection, diluez 60 μg d’ADN plasmidique MOV10-pRK5 dans 3 mL de milieu sérique réduit, puis ajoutez 120 μL de réactif d’amplification de transfection et mélangez bien.
- Dans un tube séparé, diluer 90 μL du réactif de transfection avec 3 mL de milieu sérique réduit (sans pénicilline-streptomycine) et bien mélanger.
- Ajoutez l’ADN dilué dans chaque tube de réactif de transfection dilué. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter le mélange de transfection à la culture cellulaire et cultiver les cellules pendant ~36-48 h.
- Après 36 à 48 h, prélever les cellules de chaque plaque dans un tube de 50 ml. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Laver chaque pastille avec 10 ml de PBS glacé et prélever les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Remettre la pastille en suspension dans 3 mL de tampon de lyse cellulaire contenant un cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Incuber 30 min sur glace. Centrifuger le lysat à 20 000 x g et 4 °C pendant 20 min.
- Ajouter 100 μL de billes magnétiques anti-FLAG par boîte de cellules dans un tube de 1,5 mL.
- Laver les billes magnétiques 2 fois avec un tampon K150 (50 mM HEPES à pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1 % NP-40).
- Remettez les billes magnétiques en suspension dans 1 mL de tampon K150 glacé.
- Incuber les billes magnétiques pendant 2 min à 4 °C avec une rotation douce et granuler les billes magnétiques à l’aide d’un aimant. Retirez et jetez le surnageant.
- Ajouter les billes magnétiques dans le surnageant de lysat cellulaire de l’étape 1.3.3 et incuber à 4 °C pendant 2 h.
- Laver les billes magnétiques liées aux protéines 3x avec le tampon K150, puis 2x avec le K150 contenant 250 mM de NaCl, puis 3x avec le tampon K150 comme 1.3.5.
- Remettre les billes en suspension dans 300 μL de tampon d’élution FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl à pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 % de glycérol), ajouter le peptide FLAG à une concentration finale de 0,5 μg/μL, et incuber avec des billes sur un rotateur à 4 °C pendant 1 h, puis granuler les billes magnétiques à l’aide d’un aimant.
- Prélever le surnageant qui contient les protéines MOV10 éluées, déterminer la concentration et le stocker à -80 °C pour une utilisation future.
2. Préparation des acides nucléiques
- Achetez des oligonucléotides d’ADN et d’ARN (oligos) avec ou sans marquage à la biotine auprès d’une source appropriée. Diluez chaque oligo dans de la ddH2O sans RNase jusqu’à 20 μM et maintenez-le à -80 °C pour une utilisation future.
note: Les séquences oligo des substrats d’ADN/ARN utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 2.
- Préparez le mélange suivant pour la réaction de recuit de l’ARN double brin (ARNdb) pour le dosage de l’activité hélicase MOV10 : mélanger 60 mM d’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-éthane-sulfonique (HEPES) à pH 7,5, 6 mM de KCl, 0,2 mM de MgCl2 et ddH2O sans RNase dans un volume de réaction final de 20 μL.
- L’ARN de recuit s’oligo-ucle, pour former un duplex d’ARN, en chauffant un mélange du brin supérieur marqué à la biotine (2 μM, concentration finale) et 1,5 fois de son brin inférieur complémentaire non marqué dans le tampon de recuit (étape 2.2) à 95 °C pendant 5 min, puis en le refroidissant lentement à température ambiante (RT).
3. Essais biochimiques in vitro
- EMSA et réactions enzymatiques
- Pour le dosage de l’activité hélicase MOV10, mélanger 50 mM de Tris-HCl à pH 7,5, 20 mM de KoAc, 2 mM de MgCl2, 0,01 % de NP-40, 1 mM de DTT, 2 inhibiteurs de RNase U/μL, 10 nM de substrat d’ARN marqué à la biotine, 2 mM d’adénosine triphosphate (ATP), 100 nM de piège à ARN et 20 ng de protéine MOV10 et de ddH2O dans un volume de réaction final de 20 μL. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 10 min, 30 min et 60 min. Ajoutez le tampon d’arrêt 5x pour arrêter la réaction.
note: Piège à ARN, un oligo non marqué à la biotine avec séquence, complémentarité à l’oligo marqué, qui empêche l’ARNdb déroulé de se recuire à nouveau.
- Gels de polyacrylamide
- Lavez les plaques de gel (16 cm x 16 cm) et les peignes de 1,5 mm. Assemblez les unités d’électrophorèse sur gel.
- Pour préparer un gel de polyacrylamide natif à 10 %, mélangez 14 mL de ddH2O, 1,25 mL d’acide tris-borique-EDTA (TBE), 8,3 mL d’acrylamide à 30 %, 1,25 mL de glycérol à 50 %, 187,5 μL de persulfate d’ammonium à 10 % fraîchement préparé (APS) et 12,5 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED).
- Pour préparer un gel de polyacrylamide natif à 20 %, mélangez 5,5 mL de ddH2O, 1,25 mL de 10x TBE, 1,25 mL de glycérol à 50 %, 16,7 mL d’acrylamide à 30 %, 187,5 μL d’APS à 10 % et 12,5 μL de TEMED.
- Versez immédiatement la solution d’acrylamide dans le gel et insérez le peigne. Laissez le mélange polymériser pendant environ 30 min.
- Gel running
- Retirez le peigne et remplissez les réservoirs avec le tampon d’électrophorèse (0,5x TBE).
- Rincez les puits d’échantillon avec un tampon TBE 0,5x, puis pré-exécutez le gel à 100 V sur de la glace pendant 30 min. Remplacez le tampon de coulée par un TBE frais 0,5x.
- Chargez des échantillons de 20 à 25 μL dans chaque puits.
- Utilisez un gel d’acrylamide natif à 10 % pour le dosage EMSA et un gel d’acrylamide natif à 20 % pour les tests enzymatiques. Faites fonctionner l’électrophorèse à 100 V sur le bain de glace jusqu’à ce que le marqueur bleu de bromophénol ait migré vers le quart inférieur du gel.
- Démontez les plaques de gel et coupez le gel en retirant les puits de chargement et les voies inutilisées. Placez le gel dans un tampon TBE 0,5x.
- Coupez le papier filtre et la membrane en nylon à la taille du gel. Pré-mouillez le papier filtre propre et la membrane en nylon.
- Assemblez la pile pour le transfert.
- Placez la membrane pré-humide sur le papier filtre pré-humide.
- Placez le gel sur la membrane.
- Couvrez le gel avec une autre couche de papier filtre pré-humide.
- Éliminez toutes les bulles d’air en faisant rouler une pipette propre du centre vers le bord.
- Transférer les échantillons du gel à la membrane dans un appareil électrophorétique semi-sec à 90 mA pendant 20 min.
- Arrêtez le transfert, puis séchez la membrane sur un nouveau papier filtre pendant 1 min.
- Réticulation des échantillons en irradiant la membrane à 120 mJ/cm2 pendant 45-60 s dans un réticulant à lumière UV équipé d’ampoules de 254 nm (fonction de réticulation automatique). Faites sécher la membrane à l’air libre à RT pendant 30 min.
- Détection par chimiluminescence
- Protocole 1 : Utiliser un volume standard de trousse de détection d’acides nucléiques chimiluminescents du commerce.
- Ajouter 20 mL de tampon de blocage à la membrane et incuber pendant 15 à 30 minutes en secouant doucement sur un rotateur à 20-25 tr/min.
- Préparez une solution tampon conjuguée/bloquante en ajoutant 66,7 μL de conjugué streptavide-peroxydase de raifort stabilisé à 20 mL de tampon bloquant.
- Retirez délicatement le tampon de blocage et remplacez-le par un tampon conjugué/bloquant. Incuber pendant 15 min sur un rotateur à 20-25 tr/min.
- Lavez la membrane 4 fois en secouant à 40-45 tr/min pendant 5 min chacune.
- Ajouter 30 mL de tampon d’équilibrage du substrat à la membrane. Incuber la membrane pendant 5 min en secouant à 20-25 tr/min.
- Préparez la solution de travail du substrat en ajoutant 6 mL de solution de luminol/exhausteur à 6 mL de solution de peroxyde stable. Évitez la lumière.
- Couvrir toute la surface de la membrane avec une solution de travail de substrat et incuber pendant 5 min.
- Scannez la membrane dans un système d’imagerie chimiluminescente pendant 1 à 3 s.
Tableau 1 : Les amorces utilisées pour la PCR amplifient les fragments de gènes de Meiob et Mov10.Les lettres en gras dans les amorces avant et arrière sont les sites de coupe BamHI et NotI ; les lettres en gras italique dans une amorce inversée sont des sites de coupe XhoI ; les lettres en gras dans les cases indiquent les nucléotides correspondant à la mutation ponctuelle R235A.
| Fragments | Amorces | Séquences (de 5' à 3') |
| MEIOB-A | en avant | CGGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC |
| inverse | CHEZGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG |
| MEIOB-C | en avant | CCGCGTGGATCCATGGAACAAAATACTTTACAACTTCA |
| inverse | CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG |
| MEIOB-E | en avant | CCGCGTGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC |
| inverse | CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG |
| MEIOB-E-mut | en avant | CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC |
| inverse | GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG |
| MOV10 | en avant | GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC |
| inverse | GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG |
Tableau 2 : Séquences de substrats d’ADN/ARN utilisés dans ce travail.
| Pour les chiffres | prénoms | Séquences (de 5' à 3') |
| Figures 2 et 5 | 36 nt d’ADNsb | 5'-Biotine-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (ADN) |
| Graphique 3 | 36 nt ARNss | 5'-Biotine-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (ARN) |
| Graphique 4 | 54 nt ARNdb à 5' queues | 5'-Biotine-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (ARN)
5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(ARN) |
