Visualisation par immunofluorescence des interactions entre les protéines de réparation de l’ADN

1. Extraction nucléaire et fixation cellulaire

1. Préparer des solutions mères : 0,2 M de tuyaux (pH 6,8), 5 M de NaCl, 2 M de saccharose, 1 M de MgCl₂, 0,1 M d’EGTA (pH de 8,0).
2. Préparer le tampon d’extraction nucléaire (NEB) : dissoudre 10 mM de PIPES (pH 6,8), 100 mM de NaCl, 300 mM de saccharose, 3 mM de MgCl₂, 1 mM d’EGTA (pH 8,0) et 0,5 % (v/v) de Triton X-100 dans de la jjdH₂O. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
3. Préparer du paraformaldéhyde à 4 % (v/v) (PFA) : dissoudre 10 mL de solution aqueuse de PFA à 16 % dans 30 mL de PBS. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
4. Au moment approprié (t = 0, 1, 2, 4, 16 h), laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Supprimez complètement PBS.
5. Ajouter 200 μL de NEB dans chaque puits pour l’extraction des noyaux cellulaires (le cytoplasme est dégradé, il ne reste que le noyau) (Figure 1). Incuber pendant 2 minutes à température ambiante et retirer complètement.
   note: Ne pas dépasser 2 minutes.
6. Laver les cellules avec 1 mL de PBS. Supprimez complètement PBS. Ajoutez du PBS avec précaution, les cellules sont très fragiles à cette étape.
7. Ajouter 200 μL de PFA à 4 % (v/v) dans chaque puits pour la fixation des cellules. Incuber pendant 10 minutes à 4 °C. Retirer complètement le PFA.
8. Ajouter 1 ml de PBS.
   note: Les cellules peuvent être stockées dans du PBS à 4 °C.

2. Coloration par immunofluorescence

1. Préparez la solution bloquante : dissoudre 5 % de BSA (p/v) dans du PBS et ajouter 0,3 % (v/v) de Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
2. Préparez le tampon de dilution : dissoudre 1 % de BSA (p/v) dans du PBS et ajouter 0,3 % (v/v) de Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
3. Pour le colmatage, ajoutez 200 μL de solution de blocage dans chaque puits. Incuber pendant 2 heures à température ambiante ou 16-18 heures à 4 °C.
   note: Si vous utilisez des anticorps de chèvre, ajoutez 5 % de sérum de chèvre à la solution bloquante.
4. Diluer l’anticorps primaire dans un tampon de dilution (1:500 ; voir le tableau 1 pour la liste des anticorps) et agiter jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.
   note: Si vous utilisez des anticorps de chèvre, ajoutez 1 % de sérum de chèvre au tampon de dilution.
5. Dans une boîte d’humidité/d’incubation, collez un morceau de parafilm. Ajouter 10 μL d’anticorps primaire (en une seule goutte). Alignez un bord de la lamelle avec la goutte et abaissez-le lentement sur le parafilm pour que le liquide se répande partout (évitez les bulles si possible). Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
6. Lavez les lamelles trois fois dans du PBS pendant 1 minute.
7. Diluer l’anticorps secondaire dans un tampon de dilution (concentration finale : 2 μg/mL) et agiter jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.
8. Appliquez 10 μL d’anticorps secondaires comme décrit pour les anticorps primaires. Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
   note: Protéger de la lumière.

Tableau 1 : Anticorps utilisés. Liste des anticorps utilisés dans cette étude.

9. Lavez les lamelles trois fois dans du PBS pendant 1 minute.
10. Lavez les lamelles avec H₂O pendant 1 minute.
11. Contre-coloration de l’ADN avec du DAPI : appliquer 10 μL de DAPI 300 nM (comme décrit pour les anticorps), incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis monter sur une lame de verre avec un support de montage à base de glycérol. Vous pouvez également ajouter une goutte (10 μL) de support de montage anti-décoloration commercial contenant du DAPI sur une lame et appliquer une lamelle. Appuyez doucement sur la lamelle et retirez l’excès de liquide autour de celle-ci avec une serviette en papier.
12. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent et laissez-les sécher pendant 20 minutes.
13. Stockez les lames à 4 °C.

3. Acquisition d’images

1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 60x. Utilisez DAPI pour localiser les noyaux à travers l’oculaire.
   1. Pour l’acquisition d’images XYZ, ouvrez le logiciel d’acquisition et sélectionnez les paramètres suivants : Type de scanner : Galvano ; Mode scanner : aller-retour ; Taille de l’image : 512×512 ; Mode PMT : VBF ; Moyenne PMT : cadre (4 fois) ; Balayage séquentiel PMT : ligne.
   2. Sélectionnez le colorant et les détecteurs :
      Canal (CH1), Colorant (DAPI), Détecteur (SD1)
      Canal (CH2), colorant (Alexa Fluor 488), détecteur (HSD3)
      Canal (CH3), colorant (Alexa Fluor 647), détecteur (HSD4)
   3. Sélectionnez ON dans « Z ».
2. Ajustez l’image en direct. Appuyez sur le bouton Live dans la fenêtre Live.
   1. Ajustez la mise au point et réglez l’intensité du laser ( %), la sensibilité (HV), le gain et le décalage sur la fenêtre d’outil « PMT ».
      1. Ajustez l’intensité du laser ( %) : pour la luminosité et le blanchiment. Plus l’intensité du laser est élevée, plus le signal est fort, mais l’échantillon va se photoblanchir.
      2. Ajustez la sensibilité (HV) : niveau sonore. Plus la valeur HT est élevée, plus le signal est fort, mais l’image sera bruyante si elle est trop élevée.
         REMARQUE : Gardez toujours la tension constante.
      3. Ajustez le décalage : niveau d’arrière-plan.
   2. Sélectionnez Début/Fin (15 tranches) pour les piles Z.
3. Lancez l’acquisition.
   1. Sélectionnez le dossier dans lequel vous souhaitez enregistrer les images. Appuyez sur le bouton LSM Start pour commencer à acquérir l’image. Appuyez sur le bouton Series Done pour terminer l’acquisition de l’image.

Graphique 1. Extraction nucléaire.

Images représentatives des cellules avant (à gauche) et après (à droite) l’extraction nucléaire. Le cytoplasme doit être digéré mais la structure nucléaire doit rester intacte après l’extraction (à droite). (A) Grossissement de 20x ; barre d’échelle = 20 μm et (B) grossissement de 40x ; barre d’échelle = 10 μm.