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1. Extraction nucléaire et fixation cellulaire
- Préparer des solutions mères : 0,2 M de tuyaux (pH 6,8), 5 M de NaCl, 2 M de saccharose, 1 M de MgCl2, 0,1 M d’EGTA (pH de 8,0).
- Préparer le tampon d’extraction nucléaire (NEB) : dissoudre 10 mM de PIPES (pH 6,8), 100 mM de NaCl, 300 mM de saccharose, 3 mM de MgCl2, 1 mM d’EGTA (pH 8,0) et 0,5 % (v/v) de Triton X-100 dans de la jjdH2O. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
- Préparer du paraformaldéhyde à 4 % (v/v) (PFA) : dissoudre 10 mL de solution aqueuse de PFA à 16 % dans 30 mL de PBS. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
- Au moment approprié (t = 0, 1, 2, 4, 16 h), laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Supprimez complètement PBS.
- Ajouter 200 μL de NEB dans chaque puits pour l’extraction des noyaux cellulaires (le cytoplasme est dégradé, il ne reste que le noyau) (Figure 1). Incuber pendant 2 minutes à température ambiante et retirer complètement.
note: Ne pas dépasser 2 minutes.
- Laver les cellules avec 1 mL de PBS. Supprimez complètement PBS. Ajoutez du PBS avec précaution, les cellules sont très fragiles à cette étape.
- Ajouter 200 μL de PFA à 4 % (v/v) dans chaque puits pour la fixation des cellules. Incuber pendant 10 minutes à 4 °C. Retirer complètement le PFA.
- Ajouter 1 ml de PBS.
note: Les cellules peuvent être stockées dans du PBS à 4 °C.
2. Coloration par immunofluorescence
- Préparez la solution bloquante : dissoudre 5 % de BSA (p/v) dans du PBS et ajouter 0,3 % (v/v) de Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
- Préparez le tampon de dilution : dissoudre 1 % de BSA (p/v) dans du PBS et ajouter 0,3 % (v/v) de Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
- Pour le colmatage, ajoutez 200 μL de solution de blocage dans chaque puits. Incuber pendant 2 heures à température ambiante ou 16-18 heures à 4 °C.
note: Si vous utilisez des anticorps de chèvre, ajoutez 5 % de sérum de chèvre à la solution bloquante.
- Diluer l’anticorps primaire dans un tampon de dilution (1:500 ; voir le tableau 1 pour la liste des anticorps) et agiter jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.
note: Si vous utilisez des anticorps de chèvre, ajoutez 1 % de sérum de chèvre au tampon de dilution.
- Dans une boîte d’humidité/d’incubation, collez un morceau de parafilm. Ajouter 10 μL d’anticorps primaire (en une seule goutte). Alignez un bord de la lamelle avec la goutte et abaissez-le lentement sur le parafilm pour que le liquide se répande partout (évitez les bulles si possible). Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
- Lavez les lamelles trois fois dans du PBS pendant 1 minute.
- Diluer l’anticorps secondaire dans un tampon de dilution (concentration finale : 2 μg/mL) et agiter jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.
- Appliquez 10 μL d’anticorps secondaires comme décrit pour les anticorps primaires. Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
note: Protéger de la lumière.
Tableau 1 : Anticorps utilisés. Liste des anticorps utilisés dans cette étude.
| anticorps | compagnie | référence | source |
| 53BP1 | Signalisation cellulaire | Réf. 4937 | lapin |
| Anti-souris IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | AB150103 | âne |
| Anti-phospho-histone H2A. X (Ser139), clone JBW301 | Millipore | Référence 05-636 | souris |
| IgG H&L ANTI-LAPIN (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150081 | chèvre |
- Lavez les lamelles trois fois dans du PBS pendant 1 minute.
- Lavez les lamelles avec H2O pendant 1 minute.
- Contre-coloration de l’ADN avec du DAPI : appliquer 10 μL de DAPI 300 nM (comme décrit pour les anticorps), incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis monter sur une lame de verre avec un support de montage à base de glycérol. Vous pouvez également ajouter une goutte (10 μL) de support de montage anti-décoloration commercial contenant du DAPI sur une lame et appliquer une lamelle. Appuyez doucement sur la lamelle et retirez l’excès de liquide autour de celle-ci avec une serviette en papier.
- Scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent et laissez-les sécher pendant 20 minutes.
- Stockez les lames à 4 °C.
3. Acquisition d’images
- Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 60x. Utilisez DAPI pour localiser les noyaux à travers l’oculaire.
- Pour l’acquisition d’images XYZ, ouvrez le logiciel d’acquisition et sélectionnez les paramètres suivants : Type de scanner : Galvano ; Mode scanner : aller-retour ; Taille de l’image : 512×512 ; Mode PMT : VBF ; Moyenne PMT : cadre (4 fois) ; Balayage séquentiel PMT : ligne.
- Sélectionnez le colorant et les détecteurs :
Canal (CH1), Colorant (DAPI), Détecteur (SD1)
Canal (CH2), colorant (Alexa Fluor 488), détecteur (HSD3)
Canal (CH3), colorant (Alexa Fluor 647), détecteur (HSD4)
- Sélectionnez ON dans « Z ».
- Ajustez l’image en direct. Appuyez sur le bouton Live dans la fenêtre Live.
- Ajustez la mise au point et réglez l’intensité du laser ( %), la sensibilité (HV), le gain et le décalage sur la fenêtre d’outil « PMT ».
- Ajustez l’intensité du laser ( %) : pour la luminosité et le blanchiment. Plus l’intensité du laser est élevée, plus le signal est fort, mais l’échantillon va se photoblanchir.
- Ajustez la sensibilité (HV) : niveau sonore. Plus la valeur HT est élevée, plus le signal est fort, mais l’image sera bruyante si elle est trop élevée.
REMARQUE : Gardez toujours la tension constante.
- Ajustez le décalage : niveau d’arrière-plan.
- Sélectionnez Début/Fin (15 tranches) pour les piles Z.
- Lancez l’acquisition.
- Sélectionnez le dossier dans lequel vous souhaitez enregistrer les images. Appuyez sur le bouton LSM Start pour commencer à acquérir l’image. Appuyez sur le bouton Series Done pour terminer l’acquisition de l’image.
