Dosage par extraction d’ARN-protéine pour isoler des protéines de liaison à l’ARN par extraction par affinité

Résumé

Source : Kresoja-Rakic, J., et al. Purification médiée par la desthiobiotine-streptavidine-affinité des protéines interagissant avec l’ARN dans les cellules de mésothéliome. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente un test de pull-down d’ARN in vitro pour identifier les protéines de liaison à l’ARN (RBP), qui interagissent avec les séquences d’éléments riches en adénylate-uridylate (ARE) dans l’ARNm. Les RBP cibles d’un lysat cellulaire sont mélangées à une sonde d’ARN pour former des complexes ARN-protéines. Les complexes sont isolés par purification d’affinité en utilisant l’affinité du marquage à la desthiobiotine de la sonde d’ARN avec une bille magnétique marquée à la streptavidine.

Protocole

1. Préparation de la fraction protéique cytosolique et nucléaire

1. Plaque 4 x 10⁶ cellules ACC-MESO-4 dans un flacon de culture cellulaire T150 cultivé dans un milieu RPMI - 1640 complété par 10 % de FBS, 1 x pénicilline/streptomycine (100x) et 2 mM de L-Glutamine (200 mM). Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80-90 % (~5-5,5 x 10⁶ cellules), procédez à l’extraction des protéines des fractions nucléaires et cytosoliques.
   note: La lignée cellulaire ACC-MESO-4 a été obtenue au Centre de bioressources RIKEN.
2. Aspirez le milieu, lavez les cellules en ajoutant 15 ml de 1x PBS, inclinez doucement la plaque plusieurs fois et aspirez le 1x PBS. Ajouter 3 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber le ballon de culture à 37 °C pendant 3 min
   note: Examinez les cellules au microscope pour voir si elles se détachent ; S’il est toujours attaché, tapotez la fiole contre la paume d’une main 3 fois.
3. Ajouter 7 ml de milieu RPMI-1640 complété par 10 % de FBS, 1x pénicilline/streptomycine (100x) et 2 mM de L-Glutamine (200 mM), recueillir les cellules dans un tube de 15 mL et faire tourner à 200 x g pendant 5 min.
4. Aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille de cellule avec 1,5 mL de 1x PBS, puis transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Essorer à 500 x g et 4 °C pendant 5 min. Jetez le supernatant.
   note: À partir de cette étape, effectuez toutes les étapes de centrifugation à 4 °C et conservez tous les réactifs sur de la glace.
5. Remettez la pastille cellulaire en suspension avec 1,5 mL de 1x PBS et faites tourner les cellules à 500 x g et 4 °C pendant 3 min. Jetez le surnageant.
   note: Les quantités requises de réactifs CER I, CER II et NER sont respectivement de 10, 0,55 et 5 volumes de volume estimé de pastilles de cellules emballées ; le protocole suivant suppose un volume de 20 μL. Nous vous recommandons de ne préparer que la quantité requise de réactif CER I.
6. Ajouter 200 μL de réactif d’extraction cytoplasmique glacé (CER I) complété par 2 μL d’inhibiteur de protéase 1x, par exemple, diluer 1 comprimé d’inhibiteur de protéase (sans EDTA) dans 500 μL d’eau pour obtenir 100x stock. Cette quantité de réactif CER I est suffisante pour lyser 20 μL d’un volume de cellules emballées en pastilles.
   1. Pour estimer le volume emballé des pastilles cellulaires, comparez le tube contenant les pastilles cellulaires avec un tube de 1,5 ml rempli de 10, 20, 50 ou 100 μL de 1x PBS.
7. Remettez la pastille cellulaire en suspension en faisant un tourbillon vigoureux pendant 15 secondes et incubez le tube sur de la glace pendant 10 min. Ajoutez 11 μL de réactif d’extraction cytoplasmique II (CER II) glacé dans le tube, agitez vigoureusement pendant 5 s et incubez pendant 1 min sur de la glace.
8. Agiter vigoureusement pendant 5 s et centrifuger le tube à 16 000 x g et 4 °C pendant 5 min. Transvaser le surnageant dans le tube propre et pré-refroidi sur de la glace. Le surnageant est la fraction cytoplasmique qui est ensuite utilisée dans l’expérience de pulldown de l’ARN.
9. Remettre en suspension la pastille restante dans 100 μL de réactif d’extraction nucléaire (NER) glacé complété par 1 μL d’inhibiteur de protéinase (100x) et agiter vigoureusement pendant 15 s. Nous recommandons de ne préparer que la quantité requise de réactif NER complété par des inhibiteurs de protéase.
10. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 40 minutes avec un tourbillon occasionnel pendant 15 s (toutes les 10 minutes).
11. Centrifugez le tube à 16 000 x g pendant 10 min. Transférez le surnageant (c’est-à-dire la fraction protéique nucléaire) dans un tube propre et pré-refroidi.
12. Procédez immédiatement à la mesure de la concentration en protéines à l’aide de la méthode bicinchoninique (BCA) (voir le tableau des matériaux). Pour contrôler la pureté protéique de chaque fraction, effectuer un immunotransfert (figure 1) contre la α-tubuline (détection positive uniquement dans la fraction cytosolique) et la poly ADP-ribose polymérase - PARP (détection positive uniquement dans la fraction nucléaire).
13. Afin de conserver l’activité des protéines et leur état natif, préparez 25 μL d’aliquotes d’extraits cytosoliques et nucléaires. Congelez ces aliquotes en les plaçant dans de l’azote liquide pendant 5 s et stockez-les directement à -80 °C.

2. Marquage de l’ARN avec la desthiobiotine

1. Faites synthétiser commercialement les sondes d’ARN et purifier la HPLC. Remise en suspension avec de l’eau sans nucléases à 10 μM.
   note: Les séquences de sondes sont répertoriées dans le Tableau 1.
2. Utilisez 50 pmol d’ARN par réaction d’extraction d’ARN. Décongeler et conserver tous les réactifs sur de la glace, à l'exception du PEG 30 %, utilisé pour marquer l'extrémité 3' de l'ARN oligo.
3. Transférez 5 μL de sondes d'ARN de 10 μM, étiquetées CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) et Unrelated-RNA (IRE), dans des tubes de microcentrifugation à paroi mince de 0,5 mL et incubez dans un appareil PCR à 85 °C pendant 5 min. Placez immédiatement les tubes sur ice.
   note: Cette étape est importante, car elle favorise la relaxation et l’accessibilité de la sonde d’ARN pour le marquage.
4. Pour une seule réaction de 30 μL, ajoutez dans le tube contenant de l’ARN le mélange de 10 μL suivant : 3 μL d’eau sans nucléase, 3 μL de tampon de réaction 10x ARN Ligase, 1 μL d’inhibiteur de RNase (40 U/μL), 1 μL de bisphosphate de cytidine desthiobiotinylé (1 mM) et 2 μL d’ARN ligase T4 (20 U/μL).
   note: Pour préparer un mélange maître A pour 3 échantillons en excès (3.2), mélangez 9,6 μL d’eau exempte de nucléases, 9,6 μL de tampon de réaction 10x ARN ligase, 3,2 μL d’inhibiteur de RNase (40 U/μL), 3,2 μL de cystidine bisphosphate desthiobiotinylé (1 mM) et 6,4 μL d’ARN ligase T4 (20 U/μL).
5. Ajoutez soigneusement 15 μL de PEG 30 % à la réaction. Utilisez une autre astuce pour mélanger la réaction. Incuber la réaction pendant la nuit à 16 °C.
6. Le lendemain, préparez ce qui suit : 5 M de NaCl (frais/sans nucléase), chloroforme : alcool isoamylique dans un rapport de 24:1 (p. ex., par réaction - 96 μL de chloroforme et 4 μL d’alcool isoamylique), éthanol 100 % glacé et éthanol 70 % glacé.
7. Ajoutez 70 μL d’eau exempte de nucléases dans les tubes de réaction de marquage de l’ARN. Ajouter brièvement 100 μL de chloroforme : alcool isoamylique et vortex. Essorage à 13 000 x g pendant 3 min. Retirez soigneusement UNIQUEMENT la phase supérieure et transférez-la dans un nouveau tube de 1,5 ml sans nucléase ; Évitez de toucher la phase inférieure.
8. Ajoutez 10 μL de 5 M de NaCl, 1 μL de glycogène et 300 μL d’éthanol 100 % glacé. Placez le tube à -20 °C pendant 2 h
   note: À cette étape, l’expérience peut être poursuivie le lendemain.
9. Centrifuger à 13 000 x g et 4 °C pendant 15 min. Jeter délicatement le surnageant sans déranger la pastille. Ajouter 300 μL d’éthanol glacé à 70 % et centrifuger à nouveau à 13 000 x g et 4 °C pendant 5 min.
10. Jetez complètement le surnageant et faites sécher la pastille à l’air libre (15 min). Remettre la pastille en suspension dans 20 μL d’eau sans nucléase.
    note: Procédez à l’extraction de l’ARN le même jour.
11. Incuber l’ARN à 90 °C pendant 2 min et le placer sur de la glace. Placez l’ARN marqué sur la glace lors de l’étape suivante de prélavage des billes magnétiques de streptavidine.
    note: Un temps d’incubation plus long peut endommager la sonde d’ARN.

3. Pulldown ARN-Protéine

1. Prélavage des billes magnétiques de streptavidine et incubation avec de l’ARN de la desthiobiotine
   1. Utiliser 50 μL de billes magnétiques de streptavidine par 50 pmol d’ARN. Cependant, cela devrait être optimisé en fonction de l’expérience.
   2. Vortex le tube avec des billes magnétiques de streptavidine pendant 15 s, et retirez rapidement 200 μL (mélange principal ; assez pour 3+1 réactions) dans un tube propre de 1,5 mL à l’aide d’embouts de pipette coupés. Placez le tube sur un support magnétique de manière à ce que les billes s’accumulent sur le côté du tube et attendez 1 min. Retirez le liquide de remise en suspension.
   3. Pour laver les billes, retirez le tube du support magnétique, ajoutez 400 μL de solution de NaOH 0,1 M et de NaCl 0,05 M, et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois. Replacez le tube sur le support magnétique. Attendez 1 min et récupérez le surnageant. Répétez cette étape à nouveau.
   4. Laver les billes avec 200 μL de 100 mM de NaCl. Retirez le surnageant.
   5. Ajouter 200 μL de 20 mM de Tris (pH 7,5), remettre les billes en suspension par pipetage, placer le tube sur le support magnétique, attendre 1 min et retirer le surnageant. Répétez l’étape.
   6. Retirez le tube du support magnétique, ajoutez 200 μL de tampon de capture d’ARN 1x et remettez en suspension les billes magnétiques de streptavidine en tourbillonnant brièvement. Prélever 50 μL de billes magnétiques de streptavidine et les ajouter à chaque tube d’ARN marqué à l’aide d’une pointe de pipette coupée. Incuber les tubes pendant 30 min à température ambiante sur un rouleau.
2. Liaison de la protéine à l’ARN
   1. Placez les tubes dans un support magnétique, attendez 1 minute et retirez le surnageant.
   2. Ajouter 50 μL de 20 mM de Tris (pH 7,5) dans les billes et remettre en suspension par pipetage. Placez les tubes dans un support magnétique, attendez 1 minute et retirez le surnageant. Répétez cette étape.
   3. Ajouter 100 μL de tampon de liaison protéine-ARN 1x aux billes et remettre en suspension par pipetage.
   4. Pendant ce temps, préparez le mélange suivant : 10 μL de tampon de liaison protéine-ARN 10x, 30 μL de glycérol à 50 %, 50 μg de protéines cytoplasmiques et de l’eau sans nucléase jusqu’à 100 μL.
      note: Préparez un mélange maître B pour 3 échantillons en excès (3.3) comme suit : 33 μL de tampon de liaison protéine-ARN 10x, 99 μL de glycérol à 50 %, 165 μg de protéines cytoplasmiques et de l’eau exempte de nucléases jusqu’à 330 μL. Conservez le tube du mélange maître B sur de la glace.
   5. Placez les tubes dans le support magnétique, attendez 1 min et récupérez le surnageant. Ajouter 100 μL de mélange maître B, remettre en suspension en pipetant doucement de haut en bas et éviter de créer des bulles. Incuber les tubes de réaction pendant 60 min à 4 °C sur un rouleau.
3. Lavage et élution
   1. Placez les tubes dans un support magnétique, récupérez le surnageant (qui est traversé - FT) et transférez-le dans un nouveau tube.
      note: Gardez ce FT sur la glace pour une analyse ultérieure.
   2. Pipette 100 μL de 1x Laver le tampon sur les billes, remettre doucement en suspension, remettre dans le support magnétique, attendre 1 min et jeter le surnageant. Répétez cette étape 2 fois.
   3. Ajouter 40 μL de tampon d’élution aux billes magnétiques, mélanger par pipetage de haut en bas et incuber à 37 °C sur un agitateur à tube (950 tr/min) pendant 30 min.
   4. Placez les tubes dans un support magnétique, attendez 1 min et prélevez l’échantillon élué (qui est l’éluat - E). Placer sur de la glace et utiliser pour l’analyse en aval.
      note: À cette étape, chaque sonde d’ARN testée se compose d’un échantillon à flux continu (FT) et d’un échantillon d’éluat (E).

Résultats

Figure 1 : Analyse par transfert Western de 5 μg de fraction protéique cytosolique et nucléaire. La protéine PARP est présente dans la fraction nucléaire (N) mais absente de la fraction cytosolique (C). α-tubuline est présente dans la fraction cytosolique (C) mais absente dans la fraction nucléaire (N).

Tableau 1 : Séquences des sondes d’ARN

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NE-PER Kit d’extraction nucléaire et cytoplasmique	Thermo Fisher Scientific	Référence 78833
Comprimés d’inhibiteur de protéase Pierce, sans EDTA	Thermo Fisher Scientific	N° A32965
Kit de dosage des protéines Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	Référence 23225
Kit de tirage magnétique ARN-protéine Pierce	Thermo Fisher Scientific	20164	Comprend des billes magnétiques et le kit doit donc être stocké à 4 °C
Pierce RNA 3' End Kit de Desthiobiotinylation	Thermo Fisher Scientific	20163	Le kit fait partie du « Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit », et doit être stocké à -20 °C contrairement au kit rétractable (4 °C).
DynaMag-2, support magnétique	Thermo Fisher Scientific	Référence 12321D
RPMI - 1640 moyen	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - Sérum bovin filtré	Pan Biotech	Réf. P40-37500
Pénicilline - streptomycine (100x)	Sigma-Aldrich	Réf. P4333
Solution de L-Glutamine (200 mM)	Sigma-Aldrich	Référence G7513
0,25 % Trypsine-EDTA (1x)	Gibco par Life technologies	Référence 25200-056
Solution de décontamination RNaseZap RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Synthèse d’oligo-ARN	Mycrosynth AG, Suisse	-	L’échelle de synthèse - 0,04 μmol - Purifiée par HPLC
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7030
Acide chlorhydrique (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	Référence 182883.1211
Ultra pur 1 m Tris, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific	15567027
glycérol	Thermo Fisher Scientific	Référence 17904	50 % d’aliquotes stériles à conserver à -20°C
Percer les perles magnétiques Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	Référence 88817	Veuillez noter que ces billes magnétiques ont un diamètre moyen de 1 μm (plage de 0,5 à 1,5 μm). De plus, les Dynabeads-M280 Streptavidin, qui sont des billes de taille homogène de 2,8 μm, sont également utilisées dans l’extraction de l’ARN, mais sachez que cela peut affecter le processus de purification.
Sulfate-(14-18)-hydraté d’aluminium	Sigma-Aldrich	368458
Acide orthophosphorique	Applichem	A0637