Essai de liaison in vitro basé sur SELEX pour identifier les interactions ARN-protéines

Résumé

Source : Singh, R. Exploration de l’espace séquentiel pour identifier les sites de liaison pour les protéines régulatrices de liaison à l’ARN. J. Vis. Exp. ( (2019).

Dans cette vidéo, nous décrivons l’évolution systématique des ligands par la méthode d’enrichissement exponentiel (SELEX) pour identifier des séquences spécifiques de liaison à l’ARN pour une protéine cible d’intérêt. La protéine est incubée avec un grand nombre de séquences d’ARN randomisées, et les séquences d’ARN de liaison aux protéines sont isolées, amplifiées par PCR et séquencées pour identifier leurs sites de liaison aux protéines.

Protocole

1. Réaction de liaison aux protéines et séparation de l’ARN lié

1. Effectuer la liaison des protéines et de l’ARN dans 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 dans un volume de 100 μL en ajoutant les ingrédients suivants à ces concentrations finales : 50 mM de KCl, 1 mM de DTT, 0,09 μg/μL d’albumine sérique bovine, 0,5 unité/μL de RNasin, 0,15 μg/μL d’ARNt, 1 mM d’EDTA, et 30 μL de protéine recombinante (PTB) appropriée. Ajoutez de l’ARN à partir du pool approprié.
   note: Le facteur d'épissage U2AF65 se lie généralement aux sites d'épissage du tractus polypyrimidine/3' des introns modèles avec une affinité de liaison (constante de dissociation à l'équilibre ou K_d) d'environ 1 à 10 nM. Par conséquent, les deux premiers cycles de liaison ont utilisé une concentration protéique 10 fois supérieure à la K_d pour U2AF65 ; pour les protéines SXL et PTB, la concentration de départ dans cette plage n’était que notre meilleure estimation. Cela a permis de s’assurer que les espèces d’ARN souhaitées pouvaient se lier, bien que les séquences d’affinité plus faibles aient également été potentiellement liées. Dans les cycles 3 et 4 (transcription, liaison et amplification), la concentration en protéines a été réduite de trois fois. Cela a été fait pour éliminer avec succès les espèces d’ARN de faible affinité.
2. Placez les tubes contenant les réactions de liaison pendant environ 30 min à 25 °C dans un bloc de température (ou sur de la glace).
3. Fractionnez l’ARN lié de l’ARN non lié pour les 4 premiers cycles de sélection-amplification en utilisant les étapes suivantes.
   1. Filtrez l’échantillon (100 μL) à température ambiante à travers un filtre à nitrocellulose fixé à un collecteur sous vide.
      note: Le complexe ARN-protéine, mais pas l’ARN non lié, reste sur le filtre.
   2. Coupez le filtre avec l’ARN retenu en fragments avec une lame de rasoir stérile et insérez-les dans un tube à centrifuger. Récupérez l’ARN en faisant culbuter doucement le tube pendant au moins 3 h (ou toute la nuit) avec des morceaux filtrants immergés dans le tampon protéinase K (PK).
   3. Déprotéiniser l’échantillon d’ARN en le vortex en présence d’un volume égal de phénol-chloroforme (1:1) puis de chloroforme. Récupérer la phase aqueuse à chaque fois en centrifugeant l’échantillon à grande vitesse pendant 5 min à température ambiante.
   4. Mélangez-le avec de l’acétate de sodium (0,1 volume de 3,0 M, pH 5,2) et de l’éthanol (2 à 3 volumes d’éthanol absolu, 200 proof). Laissez le tube dans un congélateur à -80 °C pendant 30 min, centrifugez-le à grande vitesse pendant 10 min et, après les étapes de lavage et de séchage, solubilisez l’ARN dans de l’eau traitée au DEPC.
4. Séparez les fractions d’ARN liées aux protéines des fractions non liées pour les 2 derniers tours (cycles 5 et 6 ; transcription, liaison et amplification) comme suit. Réduire la concentration en protéines dans la réaction de liaison (étape 1.1) de trois fois supplémentaires pour une pression de sélection supplémentaire afin d’enrichir les séquences de liaison de haute affinité et d’éliminer préférentiellement les séquences de faible affinité.
   1. Pré-mouler un gel de polyacrylamide natif (5 % avec un rapport acrylamide :bis-acrylamide de 60:1) dans un tampon TBE 0,5x (Tris-Borate-EDTA) avant de mettre en place la réaction de liaison ARN :protéine ci-dessus (étape 1.1). Électrophorèse ce gel dans une chambre froide (4 °C) en appliquant 250 V pendant 15 min.
   2. Pipeter les réactions de liaison ARN :protéine ci-dessus (étape 1.1) dans différents puits de ce gel.
      note: La protéine est stockée à -80 °C et diluée avant d’être utilisée dans 20 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES), pH 8,0, 20 % de glycérol, 0,2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,05 % de NP-40 et 1 mM de dithiothréitol (DTT). L’ajout de 0,5 à 1,0 mM de fluorure de phénylméthane sulfonyle (PMSF) inhibiteur de protéase est facultatif. Dans la réaction de liaison, ce tampon apporte environ 6 % de glycérol, ce qui permet le chargement direct des échantillons dans les puits sans qu’il soit nécessaire de les mélanger avec un tampon de chargement de gel séparé.
   3. Fractionner l’ARN lié de l’ARN non lié à l’aide de l’électrophorèse sur gel dans une chambre froide (4 °C) à 250 V pendant 1 à 2 h. Ce processus est également connu sous le nom de test de déplacement de mobilité du gel.
      REMARQUE : La durée de l’électrophorèse varie en fonction des caractéristiques de l’ARN et de la protéine utilisée pour la liaison.
   4. Exposez le gel à un film radiographique et identifiez l’emplacement de l’ARN lié à l’aide d’une autoradiographie. Découpez la tranche de gel avec l’ARN lié et insérez-la dans un tube.
   5. Incuber la tranche de gel broyée dans le tampon PK utilisé pour l’élution pendant 3 h ou toute la nuit.
   6. Vortex l’échantillon d’ARN élué vigoureusement, d’abord avec du phénol-chloroforme, puis avec du chloroforme.
   7. Mélangez de l’acétate de sodium et de l’éthanol avec la phase aqueuse après l’extraction au chloroforme. Après l’incubation dans un congélateur à -80 °C, tourner à 4 °C pendant 5 à 10 minutes pour recueillir la pastille d’ARN. Lavez la pastille d’ARN avec de l’éthanol et séchez-la à l’air libre en laissant le couvercle du tube ouvert. Dissoudre l’ARN dans l’eau traitée avec DEPC.
      note: Le passage à l’essai de déplacement de mobilité sur gel pour le fractionnement permet d’éliminer les espèces d’ARN indésirables qui auraient pu être enrichies pour se lier, par exemple, au filtre nitrocellulosique ici (ou à n’importe quelle matrice) utilisé dans les premiers cycles pour le fractionnement.

2. Transcription inverse et amplification par PCR

1. Synthétisez l’ADNc à partir de l’ARN dissous à l’aide de la transcriptase inverse et de l’amorce inverse en incubant la réaction de 20 μL (2 μL de tampon 10x RT, 2 μL de transcriptase inverse AMV, 1 μM d’amorce inverse, 10 μL d’ARN, inhibiteur de RNase facultatif) à 42 °C pendant 60 min.
2. Amplifiez l’ADNc à l’aide de 20 à 25 cycles de PCR. Fixez le promoteur de l’ARN polymérase T7 à la banque par réaction en chaîne par polymérase (PCR) contenant 1 μM de matrice de bibliothèque aléatoire d’ADN, 1 μM de chaque amorce, 20 mM de Tris (pH 8,0), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 0,1 μg/μL d’albumine sérique bovine acétylée, 2 unités de Taq polymérase et 200 μM de dNTP (désoxyguanosine, désoxyadénosine, désoxycytidine et désoxythymidine triphosphate).

3. Transcription et liaison aux protéines

1. Répétez le processus de synthèse de l’ARN, de liaison aux protéines et de séparation des fractions liées aux protéines et non liées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Équipement d’électrophorèse sur gel	standard	standard
nitrocellulose	Millipore	HAWP
nitrocellulose	Schleicher et Schuell	PROTRAN
Solutions de gel de polyacrylamide	standard	standard
Protéinase K	Oné	P8107S
PTB recombinant	Préparation en laboratoire	sans objet
Transcriptase inverse	Oné	M0277S
Collecteur à vide	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Filtre à vide pour microanalyse en verre
Collecteur à vide	Millipore	XX2702552	1225 Collecteur d’échantillonnage sous vide
Films radiographiques	standard	standard
Plaques de verre	standard	standard