1. Préparation des matériaux
- Préparez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 137 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de NaH2PO4 et 2 mM de KH2PO4, pH 7,4.
- Préparez le colorant NTA-Atto 647 N. Diluer le colorant NTA-Atto 647 N à 100 nM à partir d’une solution 100 % DMSO dans du PBS sans interpolation.
- Exprimer la protéine Vam7-His8 – en tant que protéine de fusion chez E. coli et la purifier à l’aide du Ni-NTA et de la chromatographie d’exclusion stérique.
- Titrez l’analyte dans le tampon PBS. Si l’analyte se trouve dans un tampon différent, le MST marqué n’est pas particulièrement sensible aux différences mineures de tampon avec des molécules telles que le DMSO, à moins que le contenu du tampon d’analyte n’interagisse avec la protéine marquée.
2. Préparation du dispositif MST
- Allumez l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’appareil.
- Ouvrez le logiciel de contrôle et assurez-vous que l’ordinateur portable est allumé et connecté sur l’ordinateur connecté à l’appareil.
- Entrez les paramètres de fluorescence et MST pour cette expérience. Réglez MST Before sur 3 s, MST sur 30 s et Récupération de fluorescence (Fluo.)après 1 s. Avant mesure la fluorescence initiale et ne nécessite pas de longs temps ; MST est le temps réel pour que l’équilibre soit atteint après l’induction de chaleur.
- Tableau des capillaires : Pour chaque tube capillaire, entrez le nom de la cible (ligand), le nom du ligand (analyte), la concentration de la cible et la concentration de titrage la plus élevée et utilisez le rapport de titrage automatique. Par exemple, entrez 50 nM pour la concentration cible de Vam7-His8, Vam7-His8 pour le nom de la cible, (acide 1,2-dioctanoylphosphatidique) Di-C8 PA pour le nom du ligand, et la concentration la plus élevée du ligand en sélectionnant 1:1 et en faisant glisser vers le bas pour remplir automatiquement les emplacements 2 à 16.
- Exécutez un balayage de capuchon pour sélectionner la LED appropriée (LED à 20 % (prédéfinie)) en fonction du signal de la protéine cible et ajustez entre 200 et 2000 unités de fluorescence pour le MST marqué.
- Sélectionnez une plage de puissances MST et entrez des valeurs pour chacune d’entre elles afin de tester l’ajustement de fixation le plus robuste et appuyez sur Start Cap Scan + Measurement, en balayant différentes valeurs pour déterminer les meilleures conditions de fonctionnement pour l’interaction testée.
- Déterminez la puissance MST avec le meilleur ajustement à l’aide du logiciel d’analyse et du préréglage pour la thermophorèse avec Tjump. Analysez les ajustements en fonction de la séparation de fluorescence la plus élevée entre la concentration la plus faible et la plus élevée par rapport à la puissance MST avec le meilleur ajustement et sélectionnez la puissance MST pour les essais répétés.
- Déterminez si le photoblanchiment s’est produit entre le premier et le deuxième passage en accédant au logiciel d’analyse et en basculant l’analyse en mode expert. Ensuite, sélectionnez la fluorescence au lieu de la thermophorèse pour l’analyse. Sélectionnez le mode expert puis le photoblanchiment.
3. Préparation des échantillons pour le MST marqué
- Amener la solution Vam7-His8 à une concentration de 200 nM dans du PBS sans Tween.
- Amenez le colorant NTA-Atto 647 à 100 nM en PBS sans interpolation.
- Mélangez le colorant Vam7-His8 et NTA-Atto 647 selon un rapport volumétrique de 1:1 et laissez-le reposer à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 30 min. Déterminez la concentration appropriée de protéine cible comme indiqué dans la section 2.5 (voir Supplément sur l’utilisation du KD du colorant Ni-NTA comme démontré dans la vidéo).
- Centrifugeuse d’un mélange de colorant NTA-Atto 647 N et de protéines pendant 10 min dans une pièce sombre à l’aide d’une centrifugeuse de table à environ 8 161 x g.
- Conservez le mélange à 4 °C après l’expérience ou sur de la glace pendant l’expérience pour le réutiliser quelques heures plus tard si nécessaire afin d’éviter que les protéines ne se dénaturent.
- Utilisez l’outil de recherche de concentration NT pour déterminer la plage de concentration nécessaire au titrage.
- Amener le Di-C8 PA à la concentration maximale appropriée dans l’eau.
- Titrer l’analyte à l’aide d’une dilution en série 1:1 dans un tampon PBS pour 16 concentrations en fonction de l’étape précédente. Contrairement à la SPR, la thermophorèse n’est pas aussi sensible aux différences de tampon.
4. MST des échantillons
- Allumez l’appareil et l’ordinateur portable associé.
- Appuyez sur la flèche vers le haut à l’avant de la machine et faites glisser la crémaillère capillaire vers l’extérieur.
- Chargez les capillaires dans le rack avec la concentration la plus élevée en position 1.
- Dans le logiciel de contrôle, sélectionnez le canal rouge correspondant à NTA-Atto 647 N.
- Entrez les informations de concentration, de position et de nom de chaque capillaire dans le tableau des capillaires.
- Exécutez un balayage capillaire en appuyant sur Start Cap Scan à 20 % de la LED (préréglé) et ajustez en conséquence entre 200 et 2000 unités de fluorescence à l’aide des paramètres d’intensité de la LED ou de la concentration du ligand (protéine marquée).
- Sélectionnez une plage de puissance MST.
- Démarrage Cap Scan + mesure MST.
- Analysez à l’aide du logiciel d’analyse.
