Cytométrie quantitative en flux pour étudier les interactions entre les protéines marquées et les vésicules phospholipidiques

Résumé

Source : Podoplelova, N. et al., Analyse de l’interaction des protéines marquées par fluorescence avec des microvésicules phospholipidiques artificiels à l’aide de la cytométrie quantitative en flux. J. Vis. Exp. (2022)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’interaction entre les protéines et les vésicules phospholipidiques artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux. La liaison des protéines marquées par fluorescence aux vésicules phospholipidiques marquées par fluorescence augmente l’intensité moyenne de la fluorescence, et cette augmentation est détectée par un cytomètre en flux.

Protocole

1. Détection de l’interaction protéine-lipide par cytométrie en flux

1. Expériences de liaison cinétique
   1. Diluer les vésicules phospholipidiques dans le tampon de Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM de glucose, 0,5 % BSA, pH 7,4) jusqu'à une concentration de 1 μM et un volume total de 250 μL.
   2. Mélanger le facteur de coagulation X marqué par fluorescence (fX-fd) de l’étape 1 à une concentration de 500 nM avec les vésicules phospholipidiques de l’étape 1.1.1 dans un rapport de 1:1 (concentration finale de la vésicule de 0,5 μM, la concentration de fX-fd est de 250 nM de fX) pour un volume total de 500 μL.
   3. Injecter immédiatement les 500 μL de la suspension mixte (~20 min pour une analyse avec un faible débit) dans le cytomètre en flux. Utilisez un faible débit et assurez-vous que le seuil pour le canal FL2 (excitation 488 nm, filtre d’émission 585/42 nm) est de 200. Mesurez la fluorescence moyenne dans le canal FL4 (excitation 633 nm, filtre d’émission 660/20) pour le colorant de fluorescence à partir du Tableau des matériaux.
      note: Choisissez un cytomètre sans passeur d’échantillons. Cela accélérera le processus d’injection de l’échantillon dans la cellule de mesure.
   4. Lorsque la saturation de liaison est atteinte (pas d'augmentation significative de la fluorescence dans les 5 min), diluez rapidement l'échantillon 20 fois avec le tampon de Tyrode et surveillez la dissociation jusqu'à ce que la fluorescence de base soit atteinte (dissociation complète) ou jusqu'à ce qu'un plateau soit atteint (pas de diminution significative de la fluorescence dans les 5 min).
      note: Comme contrôle, ajoutez 10 μM d’EDTA et surveillez la dissociation complète pendant 5 min.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester de succinimidyle)	Thermo Fisher Scientific	N° A37573	Colorant fluorescent
BD FACSCantoII	BD Biosciences
DiIC16(3) (perchlorate de 1,1'-dihexadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine)	Thermo Fisher Scientific	D384	Colorant fluorescent
Dmso	Sigma Aldrich	D8418
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-phosphatidylsérine (cerveau, porc) (sel de sodium)	Lipides polaires Avanti	Référence 840032P
L-α-phosphatidylcholine (cerveau, porcin)	Lipides polaires Avanti	Référence 840053P
Mini-extrudeuse	Lipides polaires Avanti	Référence 610020-1EA
chlorure de potassium	Sigma Aldrich	P9541-500G
Chlorure de calcium, anhydre, poudre, ≥97 %	Sigma Aldrich	Réf. C4901-100G
Phosphate de sodium monobasique	Sigma Aldrich	Réf. S3139-250G
chlorure de sodium	Sigma Aldrich	S3014-500G
chlorure de magnésium	Sigma Aldrich	Référence M8266-100G
Albumine sérique bovine	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
Sel disodique EDTA	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1