REMARQUE : Les tampons doivent être filtrés à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et dégazés par un vide pendant 1 h.
1. Préparation des vésicules lipidiques
- Utilisez des tubes de verre de 2 ml. Dissoudre chaque lipide, la 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), la 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), la 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (POPS) et le cholestérol (Chol) dans un mélange de chloroforme/méthanol (50:50 v/v) pour préparer une solution lipidique claire de 5 mM. Dissoudre le 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI(4,5)P2) dans un mélange de chloroforme/méthanol/eau (20:9:1 v/v).
- Combiner les lipides dissous dans le rapport molaire souhaité de POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) et POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tableau 1) dans des tubes de verre de 10 ml.
note: La quantité finale de lipides totaux est de 500 μg.
- Évaporez les solvants organiques à l’aide d’un jet sec d’azote. Laisser le mélange lipidique sous vide poussé (lyophilisation) pendant 3 h pour éliminer toute trace résiduelle des solvants.
note: Il en résulte un film transparent sec.
- Remettre le film lipidique en suspension dans 1 mL de tampon de citrate (10 mM de citrate trisodique, 150 mM de NaCl, pH 4,6). Incuber la suspension lipidique à 60 °C (cette température est d’environ 10 °C au-dessus de la température de transition de phase du lipide le plus fondu du mélange) pendant 30 min dans un bain d’eau, et agiter vigoureusement toutes les 5 min.
note: Cela se traduit par la formation de grandes vésicules multilamellaires (MLV). Maintenez la suspension au-dessus de la température de transition.
- Préchauffez l’extrudeuse (à 60 °C dans ce cas) équipée d’une membrane en polycarbonate de 50 nm de diamètre au-dessus de la température de transition (qui est ici de 40 à 50 °C) pendant 30 min.
- Chargez la suspension MLV dans l’extrudeuse préchauffée et faites passer doucement le mélange 31x à travers la membrane en polycarbonate pour former de petites vésicules unilamellaires (SUV). Maintenez la température au-dessus de la température de transition.
- Transférez la suspension SUV dans un récipient de réaction en plastique de 2 mL et ajoutez le tampon de citrate (voir étape 1.4) pour porter le volume final à 2 mL.
note: Cela donnera une concentration finale de lipides de 250 μg/mL.
2. Manipulation des capteurs à quartz
REMARQUE : Manipulez toujours les capteurs à quartz avec une pince à épiler.
- Incuber quatre capteurs insérés dans un support en polytétrafluoroéthylène dans une solution de SDS à 2 % pendant ≥ 30 min. Lavez-les abondamment à l’eau ultra-pure pour éliminer complètement les FDS et laissez-les sécher à l’aide d’un jet d’argon ou d’azote sec.
- Utilisez un système de nettoyage au plasma pour éliminer complètement tous les contaminants. Insérez les capteurs secs dans la chambre de nettoyage au plasma, évacuez la chambre et rincez-la 3 fois avec de l’oxygène. Allumez le nettoyeur plasma. Utilisez les paramètres de processus suivants : pression Torr de 1 x 10-4, puissance radiofréquence (RF) élevée et 10 min de temps de traitement. Éteignez la machine et retirez les capteurs.
3. Fonctionnement de la microbalance
REMARQUE : Un système de microbalance avec quatre chambres d’écoulement à température contrôlée en configuration parallèle, connectées à une pompe péristaltique et réglées à un débit de 80 μL/min, a été utilisé. En mode d’écoulement ouvert, le tampon a été pompé du réservoir d’alimentation dans le réservoir de réception. En mode boucle, le réservoir récepteur a été connecté au réservoir d’alimentation pour générer une boucle fermée. La température a été fixée à 20 °C.
- Fixez soigneusement les capteurs nettoyés au plasma dans les 4 chambres d’écoulement, à l’aide d’une pince à épiler. Évitez toute pression ou torsion des chambres et des tubes qui pourrait provoquer des fuites.
- Rincer le système avec un tampon de citrate (10 mM de citrate trisodique, 150 mM de NaCl, pH 4,6) en mode d’écoulement libre pendant 10 min
note: Cela nécessite exactement 3,2 ml de tampon, mais il est conseillé d’utiliser un excès de tampon (10 ml).
- Lancez le programme. Commencez à enregistrer à l’aide du logiciel tout changement de fréquence et de dissipation de la première tonalité fondamentale (n = 1er) et des harmoniques (n = 3e - 13e) à l’aide du logiciel, jusqu’à ce que les lignes de base de fréquence et de dissipation soient stables (cela prendra environ 40 à 60 min).
note: Les niveaux de bruit fréquentiel (crête à crête) doivent être inférieurs à 0,5 Hz et, pour la dissipation, inférieurs à 0,1,10-6, avec une dérive maximale (en solution aqueuse) de 1 Hz/h en fréquence et de 0,3,10-6/h en dissipation.
- Lorsque les lignes de base sont stables, appliquez la suspension SUV dans un tampon de citrate (2 mL dans un petit tube). À l’aide d’un récipient de réaction, prélever 1,5 mL du volume mort. Fermez ensuite le système en mode loop-flow. Enregistrez le décalage de fréquence/dissipation pendant 10 minutes supplémentaires.
note: Pendant ce temps, les vésicules s’étendront sur la surface de SiO2 et fusionneront pour former une bicouche continue (étape 2 des figures 1, 2 et 3). L’adsorption du SUV à la surface du capteur est biphasique et a une fréquence minimale et maximale typique dans la dissipation. Une nouvelle ligne de base de fréquence/dissipation stable avec un décalage de fréquence caractéristique (en fonction de la composition lipidique) de 26 à 29 Hz (voir tableau 1) indique une bicouche continue à la surface.
- Lorsque le SLB est stable (voir étape 3.4), équilibrez le système avec le tampon en fonctionnement (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) aux concentrations requises de Ca2+ (allant de 50 μM à 1 mM CaCl2, selon l’expérience) en mode d’écoulement ouvert pendant 40 min.
- Ajoutez la protéine (ici, AnxA2) au tampon de fonctionnement contenant Ca2+ (voir étape 3.5). Effectuez l’application de la protéine en mode d’écoulement en boucle jusqu’à ce qu’un état d’équilibre soit atteint (étape 3 de la Figure 1, Figure 2 et Figure 3).
note: La concentration en protéines peut varier de 1 à 400 nM. L’adsorption des protéines entraîne un décalage de fréquence dépendant de la concentration reflétant l’adsorption de masse (protéine).
- Dissocier la protéine liée en chélant les ions Ca2+ avec 5 mM d’EGTA dans le tampon de fonctionnement en mode d’écoulement ouvert (étape 4 des figures 1 et 2).
note: Une récupération de la fréquence et une dissipation à la ligne de base SLB indiquent une réversibilité totale de la liaison aux protéines. Les cycles d’association-dissociation peuvent être répétés pour comparer différentes concentrations ou protéines.
