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1. Imagerie de la formation de la condensation EWS-FLI1 sur des rideaux d’ADN
- Ouvrez le logiciel d’imagerie, trouvez et marquez les positions des 3 × 3 motifs en zigzag sous le champ clair.
- Allumez le débit à 0,2 mL/min pour colorer l’ADN avec le colorant d’ADN double brin pendant 10 min.
- Diluez mCherry-EWS-FLI1 avec le tampon d’imagerie à la concentration de 100 nM dans 100 μL dans le tube.
- Chargez l’échantillon de protéines à travers la valve à l’aide d’une seringue en verre de 100 μL et modifiez le débit à 0,4 mL/min.
- Allumez le laser 488 nm et pré-balayez chaque région pour vérifier l’état de distribution de l’ADN ; sélectionnez la région où les molécules d’ADN se répartissent uniformément. Réglez la puissance laser sur 10 % pour le laser 488 nm et 20 % pour le laser 561 nm. Utilisez le wattmètre pour mesurer la puissance réelle du laser près du prisme : 4,5 mW pour le laser 488 nm et 16,0 mW pour le laser 561 nm.
- Acquisition d’images
- Commencez à acquérir des images à des intervalles de 2 s avec des lasers de 488 nm et de 561 nm simultanément.
- Passez de la vanne du mode manuel au mode injection pour permettre au tampon d’imagerie de rincer l’échantillon de protéines dans la cellule d’écoulement après 60 s.
note: Ce processus prendra ~30 s, et le champ de vision sera couvert par des signaux mCherry dès que les protéines EWS-FLI1 atteignent la cellule d’écoulement.
- Pour supprimer l’EWS-FLI1 libre, continuez à laver la cellule d’écoulement avec le tampon d’imagerie pendant 5 min avec uniquement le laser 561 nm allumé. Arrêtez l’écoulement et incubez à 37 °C pendant 10 min.
- Allumez le flux à 0,4 mL/min pour permettre à l’ADN de s’étendre, et acquérez des images à des intervalles de 2 s entre différentes images pour obtenir des données à haut débit sur la formation de condensats EWS-FLI1.
2. Analyse d’intensité pour mCherry-EWS-FLI1
- Importez les données sous forme de séquences d’images dans le logiciel ImageJ, choisissez les points sur 25 × sites GGAA dans un carré de 8×8 pixels et enregistrez l’image dans .tif format.
- Calculez l’intensité comme la somme de l’intensité dans le carré de 8×8 pixels, y compris l’ensemble des pixels, et supprimez l’arrière-plan en soustrayant l’intensité de l’arrière-plan dans une zone de la même taille près du carré de 8 x 8 pixels.