Dosage de la modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées pour détecter les interactions protéine-phosphoinositide

Résumé

Source : Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip : A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (2017)

Dans cette vidéo, nous démontrons les interactions protéine-phosphoinositide dans un motif microfluidique à l’aide du test de modulation du pH, en utilisant un colorant fluorescent sensible au pH marqué sur le lipide phosphatidyléthanolamine d’une bicouche lipidique supportée, appelée plateforme microfluidique. Les modulations du pH après la liaison des protéines aux phospholipides provoquent l’extinction de la fluorescence.

Protocole

1. Formation de bicouches lipidiques supportées (SLB)

1. Transférez 100 μL de VUS contenant du PI(4,5)P2 dans un tube de microcentrifugation de 0,65 mL. Ajustez le pH de la solution à ~3,2 en ajoutant 6,4 μL d’acide chlorhydrique 0,2 N.
   note: Confirmez le pH de la solution à l’aide d’un pH-mètre équipé d’une micro sonde de pH (voir tableau des matériaux).
2. Pipeter 10 μL de la solution SUV au pH ajusté dans chaque canal par l’entrée et appliquer une pression à travers la pipette jusqu’à ce que la solution atteigne la sortie. Détachez l’embout de la pipette et laissez-le attaché à l’appareil.
3. Répétez l’étape ci-dessus pour chaque canal, puis incubez l’appareil pendant 10 min à RT.
   note: L’injection des vésicules dans les microcanaux doit être effectuée immédiatement après l’assemblage du dispositif.
4. Coupez des jeux de tubes d’entrée et de sortie de 60 cm (tube d’entrée) et de 8 cm (tube de sortie) de longueur, respectivement.
   note: En coupant le tube en diagonale et en créant un bord tranchant, il est plus facile d’insérer le tube dans les entrées et les sorties. Le tube de sortie doit avoir une forme d’arc. La longueur du tube d’entrée peut varier en fonction de la configuration du microscope. Le diamètre intérieur du tube est de 0,05 cm.
5. À l’aide d’une pince à épiler, connectez le jeu de tubes de sortie à l’appareil, puis collez l’appareil sur une platine de microscope.
6. Immergez une extrémité du tube d’entrée dans 25 ml de tampon de coulée contenu dans un tube conique et collez-le pour vous assurer que le tube est bien fixé.
7. Placez le tube conique sur un sol plus élevé (~20 cm) que l’appareil afin de pousser la solution à travers les microcanaux par gravité ; un jack de laboratoire peut être utilisé pour y parvenir.
8. Pour chaque tube d’entrée, à l’aide d’une seringue, prélever 1 mL de tampon de coulée à l’extrémité libre du tube. Retirez l’embout de la pipette de l’entrée et insérez l’extrémité libre du tube d’entrée dans l’appareil.
   note: Introduisez une goutte de tampon courant sur l’entrée pour réduire la probabilité qu’une bulle d’air soit introduite dans le canal pendant cette étape. Une fois le tube d’entrée fixé à l’appareil, utilisez une lingette non pelucheuse pour retirer l’excès de tampon.
9. Répétez l’étape ci-dessus pour connecter tous les morceaux de tube d’entrée à l’appareil.
   note: L’écoulement du tampon à travers les canaux permet d’éliminer les vésicules en excès et d’équilibrer la bicouche dans les conditions expérimentales.
10. Ouvrez le logiciel de contrôle du microscope (voir tableau des matériaux). Dans le panneau de gauche, cliquez sur l’onglet « Microscope » et choisissez l’objectif « 10X ».
11. Cliquez sur les icônes d’image « Live » puis « Alexa 568 » dans la barre d’outils. À l’aide des boutons de réglage fin et de course, concentrez-vous sur les microcanaux.
12. Parcourez l’appareil pour vérifier la qualité des SLB et des canaux (Figure 1). Ensuite, cliquez sur l’icône d’image « FL Shutter Closed » dans la barre d’outils.
13. Cliquez sur l’onglet « Acquisition », puis sous « Réglages de base », sélectionnez « Temps d’exposition ». Réglez le temps d’exposition sur « 200 ms ».
14. Sur le panneau de gauche, cliquez sur « Acquisition multidimensionnelle » et dans le menu des filtres, sélectionnez le canal rouge (marqué comme « Alexa 568 »). Ensuite, cliquez sur le menu « time lapse », réglez l’intervalle de temps sur 5 min, la durée sur 30 min, et cliquez sur « Démarrer ».
    note: Sur la base de la durée (30 min) et du débit (~1,0 μL/min), 30 μL de tampon de fonctionnement sont utilisés pour équilibrer le SLB dans un canal, c’est-à-dire que 240 μL de tampon de fonctionnement sont utilisés pour les 8 canaux.
15. Sélectionnez l’outil « Cercle » sous l’onglet « Mesurer » et dessinez un cercle dans n’importe quel canal. Faites un clic droit pendant que le cercle est sélectionné et choisissez « Propriétés ». Sous l’onglet « Profil », cochez « tous les T » pour visualiser l’intensité de fluorescence en fonction du temps.
    1. Assurez-vous que cette courbe atteint un plateau, qui indique l’équilibre, avant de passer à l’étape suivante.
16. Abaissez la solution tampon à un niveau égal à celui de l’appareil pour arrêter l’écoulement.
17. Enregistrez le fichier time lapse.

2. Test de l’interaction du domaine PH PLC-δ1 avec des SLB contenant PI(4,5)P2

1. Préparez les dilutions du domaine PH en utilisant le tampon en cours d’exécution comme diluant.
   note: Comme il y a huit canaux dans l’appareil, utilisez-en au moins deux pour les commandes vierges. Choisissez les extrémités les plus éloignées de chaque côté et utilisez les canaux restants pour les dilutions de protéines. Les concentrations suivantes dans le domaine du PH ont été testées : 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 et 2,50 μM. Environ 200 μL de chaque dilution étaient suffisants pour atteindre l’équilibre en 30 minutes.
2. Un à la fois, détachez chaque tube de sortie et appliquez 200 μL de chaque dilution de protéine dans le canal de sortie à l’aide d’une pipette. N’appliquez aucune pression, laissez la gravité faire le travail. Détachez l’embout de la pipette et laissez-le fixé au dispositif microfluidique.
3. Répétez l’étape ci-dessus pour chaque canal et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans les canaux pendant ce processus.
4. Abaissez le tube d’entrée jusqu’à un sol sous le dispositif microfluidique pour commencer à faire circuler la protéine à travers les microcanaux. Collez l’extrémité libre du tube sur un conteneur à déchets. Écoulez les dilutions protéiques pendant 30 min.
   note: Cela inversera le flux et permettra à la protéine d’être introduite dans les canaux. Le temps d’équilibrage et le volume des dilutions protéiques nécessaires dépendront de l’affinité de l’interaction.
5. Sur le panneau gauche du logiciel, sous l’onglet « Time Lapse », cliquez sur « Démarrer » pour recommencer l’imagerie.
6. Une fois l’expérience terminée, enregistrez le fichier timelapse.

Résultats

Figure 1 : Évaluation de l’intégrité des SLB et des microcanaux. (A) Une image illustrant des SLB et des microcanaux de haute qualité. (B) Fusion incomplète. (C) Microcanaux fusionnés. (D) Particule de poussière piégée dans un microcanal. (E) Bulles d’air piégées dans des microcanaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine	Lipides polaires Avanti	Référence 850457C	POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate	Lipides polaires Avanti	Référence 840045X	PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate	Lipides polaires Avanti	Référence 840046X	PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine	Lipides polaires Avanti	Référence 850757C	pape; Nécessaire à la synthèse de l’oSRB-POPE
Chlorure de lissamine et de rhodamine B sulfonyle (mélange d’isomères)	ThermoFisher Scientific	L-20	Nécessaire à la synthèse de l’oSRB-POPE
Sonde lipidique fluorescente sensible au pH (oSRB-POPE)	À l’interne	n/a	Synthèse interne (Huang, D., et al., 2013)
Microscope à épifluorescence Axiovert 200M	Microscopie Carl Zeiss	n/a	microscope
Caméra AxioCam MRm	Microscopie Carl Zeiss	n/a	caméra
X-Cite 120	Excelitas Technologies	n/a	source lumineuse
Ensemble de filtres Alexa 568	Microscopie Carl Zeiss	n/a	Ex/Em 576/603 nm
Logiciel AxioVision LE64 v.4.9.1.0	Microscopie Carl Zeiss	n/a	Logiciel de traitement d’images
Conseils	VWR	Référence 10034-132	pointes de pipette de 200 uL ; Pointe fine et lisse pour l’application de la solution protéique dans le canal microfluidique
Conseils	VWR	Référence 53509-070	10 uL pointes de pipette ; Pointe fine et lisse pour l’application de la solution vésiculaire dans le canal microfluidique
pH-mètre Orion Star A321	Thermo Scientific	STARA3210	Ph-mètre
Microsonde de pH Orion	Thermo Scientific	8220BNWP	microsonde de pH
Acide N-(2-hydroxyéthyl)-pipérazine-N'-(acide 2-éthanesulfonique)	VWR	VWRB30487	HEPES, acide libre
chlorure de sodium	VWR	BDH8014-2,5 KGR	NaCl
tubage	Allied Wire & Cable	TFT-200-24 N	Diamètre interne : 0,020-0,026 pouces (0,051-0,066 cm) ; Épaisseur de la paroi : 0,010 pouces (0,025 cm) ; Tubes souples en polytétrafluoroéthylène à paroi mince ; Couleur naturelle
Azote gazeux - Industriel	Praxair	n/a	Fournisseur local
Oxygène gazeux - Industriel	Praxair	n/a	Fournisseur local
azote liquide	Praxair	n/a	Fournisseur local