1. Configuration du réactif et de la solution
- Pour préparer du DMEM complet, ajoutez 5 mL de L-glutamine 200 mM, 5 mL de pénicilline-streptomycine 100x et 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS, concentration finale de 10 % vol/vol) à 440 mL de DMEM.
note: Cette solution peut être conservée à 4 °C pendant 1 mois.
- Préparez une solution d’agarose en dissolvant 150 mg d’agarose faiblement gélifiante dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 85 °C pour obtenir une solution à 1,5 % (p/v). Stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 μm. Préparer 1 mL d’aliquotes d’une solution d’agarose dans 1,5 N
- Préparez le milieu du bioréacteur.
- Dissoudre 13,4 g de poudre de DMEM dans 1 L de H2O.
note: Selon l’application, le volume final requis peut différer (par exemple, pour un milieu de 500 ml, dissoudre 6,7 g de poudre dans 500 mL H2O).
- Ajouter 2 % de FBS, 10 mM de NaHCO3, 1 x pénicilline-streptomycine (100x) et 2 % deD2O (p. ex., pour un milieu de 500 ml, ajouter 10 mL de FBS, 0,4 g de NaHCO3, 5 mL de pénicilline-streptomycine 100x et 10 mL de D2O).
- Mesurez le pH à l’aide d’un pH-mètre et, si nécessaire, ajustez-le à 7,4 en ajoutant HCl.
note: En règle générale, le pH initial est très proche de 7,4.
- Filtrez le milieu du bioréacteur à l’aide d’un filtre stérile entraîné sous vide dans une bouteille en verre stérile de 250 ml ou 500 ml.
- Dans la hotte à flux laminaire, scellez le flacon à l’aide d’une tête en acier stérile avec deux buses de tuyau et connectez-les à un tube FEP (d.E. = 1/8", D.I. = 1,6 mm) qui sera connecté à la pompe et à un filtre de seringue en PTFE de 0,22 μm pour l’admission d’air.
2. Configuration du bioréacteur
- Assemblez l’unité d’écoulement à l’aide d’un deuxième tube RMN d’unité d’analyse, qui sera ensuite remplacé par celui contenant les cellules. Reportez-vous au mode d’emploi de l’unité de débit pour le montage correct.
note: À ce stade, l’unité de débit doit déjà être nettoyée (si ce n’est pas le cas, effectuez l’étape 4.2).
- Réglez le bain-marie connecté à la commande de température de l’unité de débit sur 37 °C. Placez la bouteille réservoir dans le bain-marie.
- Connectez le tube FEP de la bouteille réservoir à la pompe.
- Tournez la vanne du bioréacteur sur « bypass » et préremplissez la pompe avec un fluide.
- Tournez la vanne du bioréacteur sur « flow » et préremplissez le bioréacteur avec le fluide à 0,1 mL/min.
3. Préparation de l’échantillon de cellule
- Prélever les cellules de l’incubateur de CO2.
- Prélever une fiole T75 contenant des cellules de HEK293T transfectées de l’incubateur de CO2 et prélever le milieu usé.
- Lavez les cellules deux fois avec 7 ml (chacune) de PBS à température ambiante (~20 °C).
- Utilisez 2 ml de trypsine/EDTA pour détacher les cellules. Après avoir ajouté la solution, incuber 5 min à température ambiante pour détacher les cellules.
note: Les cellules transfectées peuvent prendre un peu plus de temps à se détacher. Si nécessaire, incubez les cellules à 37 °C.
- Inactiver la trypsine avec 20 mL de DMEM complet ; remettre complètement les cellules en suspension en les pipetant de haut en bas et en les transférant dans un tube à centrifuger de 50 mL.
- Centrifugez les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant.
- Lavez les cellules avec 10 ml de PBS à température ambiante pour éliminer le milieu résiduel.
- Centrifugez les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant.
- Transférez la pastille de cellule dans un tube de microcentrifugation bouché de 1,5 ml.
- Incorporez des cellules dans des fils d’agarose.
- Faire fondre une aliquote d’agarose solidifiée à 85 °C dans un bain-marie, puis la maintenir en solution à 37 °C dans un chauffe-moteur.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, remplissez le fond du tube RMN de l’unité d’écoulement avec 60 à 70 μL de gel d’agarose à 1,5 % et placez-le dans de la glace. Cela créera un bouchon inférieur de ~5 mm de haut qui permettra de placer l’échantillon de cellule dans le volume actif de la bobine RMN 1H.
- Chauffer la pastille de cellules obtenue à l’étape 3.1.8 à 37 °C pendant 15 à 20 s dans le thermobloc.
- Remettre les cellules en suspension dans 450 μL de solution d’agarose. Attention à éviter la formation de bulles.
- Aspirer la suspension d’agarose cellulaire dans un tube PEEK de chromatographie de ~30 cm de long (i.d. = 0,75 mm) relié à une seringue de 1 mL.
note: Avant l’aspiration, la tubulure et le volume mort de la seringue doivent être pré-remplis de PBS à température ambiante pour éviter la formation de bulles. La longueur du tube n’est pas critique.
- Laissez le tube refroidir à température ambiante pendant 2 min.
- Préremplissez le tube RMN de l’unité d’écoulement avec 100 μL de PBS à température ambiante.
- Coulez des fils de cellules nobsées dans l’agarose dans le tube RMN de l’unité d’écoulement en poussant doucement la seringue.
note: Pour remplir le tube RMN de manière homogène, commencez par placer l’extrémité du tube PEEK au bas du tube RMN et continuez vers le haut tout en vous balançant lentement de gauche à droite.
- Répétez les étapes 3.2.5, 3.2.6 et 3.2.8 jusqu’à ce que toute la suspension d’agarose cellulaire ait été coulée.
- Insérez les cellules dans le bioréacteur.
- Retirez le tube RMN vide de l’unité de débit et augmentez le débit à 2 mL/min pendant quelques minutes pour éliminer les bulles de gaz résiduelles dans le tube d’entrée.
- Réglez le débit à 0,2 mL/min et insérez le tube RMN contenant les cellules en le poussant lentement mais sûrement vers le haut.
note: L’écoulement actif du fluide évite le reflux du contenu du tube à travers l’entrée qui se produirait autrement lors de l’insertion.
4. Fonctionnement et nettoyage du bioréacteur
- Fonctionnement du bioréacteur pendant l’expérience RMN.
- Réglez la température dans le spectromètre RMN à 310 K.
- Insérez l’unité de débit dans le spectromètre.
- Fournir le milieu du bioréacteur à un débit de 0,1 mL/min pendant toute la durée des expériences de RMN en cellule.
- Au moment souhaité au cours de l’expérience, injecter une solution concentrée de la molécule externe dans le flacon réservoir moyen en perçant le tube en silicone avec une seringue stérile à aiguille longue.
note: La concentration finale de la molécule dans le milieu doit être choisie en fonction des connaissances antérieures sur la toxicité cellulaire et, le cas échéant, du taux de diffusion prévu/estimé à travers la membrane cellulaire.
- À la fin de l’expérience RMN, remplacez le tube contenant les cellules par un tube vide et rincez l’unité d’écoulement avec de l’eau.
- Nettoyage en place du bioréacteur.
- Nettoyez l’unité d’écoulement en faisant couler les solutions suivantes à 1 mL/min : 0,2 M d’hydroxyde de sodium (NaOH), 3 M d’acide citrique, 0,2 M de NaOH, pendant au moins 30 minutes chacune, suivie d’une eau ultrapure filtrée stérile pendant >2 h.
- Nettoyez et autoclavez le réservoir, la bouteille et le tube après chaque passage.
5. Expériences RMN
- Mise en place des expériences RMN.
note: Effectuez ces étapes en amont, avant la préparation de l’échantillon RMN en cellule, afin d’éviter tout retard entre la collecte des cellules et l’acquisition des données.
- Créez un nouvel ensemble de données au niveau du spectromètre RMN et définissez les paramètres des expériences RMN souhaitées.
- Définissez les paramètres pour les expériences RMN 1D 1H.
- Centrez la fréquence porteuse 1H à 4,7 ppm sur le signal d’eau.
- Sélectionnez le programme d’impulsion zgesgp, réglez la largeur spectrale sur 20 ppm et une impulsion carrée de 1 000 μs à 180° pour la suppression de l’eau. Définissez un délai inter-balayage de 1 s. Acquérez le spectre avec 32 balayages.
- Pour les cellules exprimant un CA II non marqué : sélectionnez le programme d’impulsions p3919gp, réglez la largeur spectrale sur 30 ppm pour couvrir la région imino du spectre, et ajustez le retard pour la suppression binomiale de l’eau de sorte que l’excitation maximale soit centrée sur les décalages chimiques des signaux d’intérêt (d7 = 20 μs à 950 MHz). Définissez un délai entre les balayages de ≥1 s. Acquérez avec 512 scans.
- Pour les cellules exprimant 15SOD1 marquées N : sélectionnez le programme d’impulsions sfhmqf3gpph, réglez les largeurs spectrales 1H et 15N à 16 et 50 ppm, respectivement, le décalage d’impulsion profilé et la bande passante d’excitation à 8,5 et 6 ppm, respectivement, et une impulsion de 350 μs pour le schéma de découplage (garp4 ou autre selon l’instrument). Réglez un délai entre les balayages de 0,3 s. Acquérez 16 numérisations et 128 incréments dans la dimension 15N.
- Acquisition de spectres RMN en temps réel.
- Une fois le bioréacteur inséré dans le spectromètre RMN, attendre quelques minutes pour permettre l’échange du fluide.
note: Ce processus est facilement surveillé dès l’apparition du signal de verrouillage car le PBS est remplacé par un fluide contenant 2 % de D2O.
- Ajustez l’adaptation et le réglage du canal 1H, calez l’aimant et calculez la longueur d’impulsion dure de 1H à 90°.
- Ajustez les niveaux de puissance 1H dans chaque séquence d’impulsions en fonction de l’impulsion dure de 1H.
- Enregistrez un premier spectre zgesgp 1H pour vérifier le contenu de l’échantillon et l’homogénéité du champ.
- Copiez les expériences zgesgp et p3919gp/sfhmqcf3gpph jusqu’au numéro souhaité et mettez-les en file d’attente dans le spouleur d’acquisition.
CA: Les spectres zgesgp ne sont utilisés que pour contrôler l’état de l’échantillon et l’homogénéité du champ ; Par conséquent, ils peuvent être sautés ou enregistrés moins fréquemment.
- Pour les cellules exprimant CA II non étiqueté : traiter les spectres p3919gp en appliquant la fonction de remplissage du zéro et de fenêtre d’élargissement des raies exponentielles (LB = 20 Hz).
- Pour les cellules exprimant 15SOD1 marquées N : traiter les spectres sfhmqcf3gpph en appliquant un remplissage nul et une fonction de fenêtre en cloche sinusoïdale carrée (SSB = 2) dans les deux dimensions.
note: La taille des spectres traités peut être encore réduite en supprimant les régions exemptes de signaux (dans Topspin, cela se fait en réglant les valeurs STSR et STSI souhaitées).
