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REMARQUE : Voici les étapes pour le criblage des phages T7 reconnaissant les médicaments à l’aide d’un biocapteur QCM et la récupération des phages criblés via une infection à E. coli (BLT5615). Les protocoles pour la synthèse d’un dérivé d’une petite molécule qui forme une monocouche auto-assemblée (SAM) et pour la construction de la bibliothèque de peptides aléatoires de 15 mères affichées par phage T7 peuvent être trouvés ailleurs.
1. Préparation de la puce du capteur QCM
- Fixez une puce de capteur en céramique sur l’oscillateur d’un appareil QCM de 27 MHz et enregistrez la fréquence intrinsèque (Hz) dans la phase aérienne avant l’immobilisation des petites molécules.
- Détachez la puce et déposez 20 μL d’une solution (1 mM dans de l’éthanol à 70 %) d’un dérivé de petite molécule qui forme SAM sur l’électrode en or de la puce du capteur à l’aide d’une pipette.
prudence: Le cristal de la puce du capteur où se trouve l’électrode en or (Au, 0,1 mm d’épaisseur, 2,5 mm de diamètre intérieur, 4,9 mm2) est extrêmement fin et peut se fissurer facilement (SiO2, 0,06 mm d’épaisseur, 9 mm de diamètre intérieur). Par conséquent, pipetez soigneusement.
- Laisser reposer 1 h à température ambiante (environ 20 °C) dans une boîte de Pétri avec un mouchoir humidifié et à l’abri des lumières de la pièce.
- Lavez doucement la surface de l’électrode avec de l’eau ultra-pure, puis retirez les gouttes d’eau en soufflant de l’air avec une seringue ou un dépoussiéreur.
- Installez la puce du capteur pour l’appareil QCM et enregistrez la réduction de fréquence dans la phase aérienne pour mesurer la quantité de petite molécule qui a été immobilisée.
note: Au moins, 100 Hz de fréquence intrinsèque sont nécessaires pour une immobilisation réussie des petites molécules (1 Hz immobilise 30 pg).
2. Biopannage de la banque de phages T7 à l’aide d’un biocapteur QCM (Figure 1)
- Placez une cuvette avec un agitateur magnétique dédié sur le biocapteur QCM et versez 8 ml du tampon de réaction (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) dans la cuvette.
- Fixez la puce du capteur QCM à l’oscillateur et tirez le bras de l’oscillateur vers le bas pour immerger la puce dans le tampon en cours d’agitation à 1000 tr/min.
- Commencez à surveiller la fréquence QCM sur l’ordinateur personnel (PC) et attendez que le sensorgramme s’équilibre à environ 3 Hz/min de la dérive de fréquence.
- Injectez 8 μL d’une banque de phages T7 (1—2 × 1010 pfu/mL) dans la cuvette (concentration finale : 1—2 × 107 pfu/mL) et marquez le point d’injection sur le capteur.
- Surveiller la réduction de fréquence provoquée par la liaison des phages T7 à la petite molécule immobilisée à la surface de l’électrode d’or pendant 10 min.
- Arrêtez le moniteur de fréquence QCM, délogez la puce du capteur de l’oscillateur et retirez le tampon en soufflant de l’air et/ou en évacuant l’humidité avec des lingettes.
- Placez la puce du capteur dans une boîte de Pétri humide et déposez les 20 μL de suspension d’E. coli (BLT5615) (DO600 = 0,5—1,0 après agitation à 37 °C en ajoutant IPTG à 1 mM) cellules hôtes en phase logarithmique sur l’électrode en or.
- Fermez le couvercle du plat et couvrez-le de papier d’aluminium pour bloquer la lumière.
- Incuber la parabole à 37 °C pendant 30 min sur un mélangeur à microplaques de 96 puits (1000-1500 tr/min) pour améliorer la récupération des phages T7 liés.
- Récupérez les 20 μL de la solution et suspendez-la dans 200 μL de LB medium.
note: Les échantillons obtenus lors de cette étape peuvent être conservés à 4 °C pendant une semaine.
- Préparez une série de dilutions de la solution de phage pour l'isolement des plaques et le séquençage de l'ADN conformément à la procédure générale décrite dans les instructions du fabricant.
