Chromatographie d’exclusion stérique avec diffusion de la lumière multi-angle pour les oligomères de protéines

Résumé

Source : Some, D. et al., Caractérisation des protéines par chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion multi-angle de la lumière (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit la SEC-MALS, qui exploite les capacités de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et de la diffusion de la lumière multi-angle (MALS). Dans SEC-MALS, le SEC sépare les protéines ou les complexes protéiques en fonction de leur taille, et le détecteur MALS détermine le poids moléculaire moyen en mesurant l’intensité de la lumière diffusée par la molécule sous différents angles.

Protocole

1. Préparation du système

1. Connectez les détecteurs MALS et dRI en aval du détecteur UV du FPLC. Contournez les détecteurs de pH et de conductivité car ils ajouteront un volume inter-détecteurs significatif entre les détecteurs UV et MALS. Utilisez un tube capillaire de 0,25 mm de diamètre intérieur de la colonne vers et entre les détecteurs, et un tube capillaire de 0,75 mm de diamètre intérieur à la sortie des détecteurs vers le collecteur de déchets ou de fractions.
2. Assurez-vous que les connexions de signal nécessaires entre le FPLC et les détecteurs ont été établies, y compris la sortie analogique du détecteur UV vers l'entrée....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AKTA pur	GE Soins de santé	Référence : 29-0182-26	Chromatographe liquide à protéines rapides (FPLC)
AKTA LICORNE	GE Soins de santé		Logiciel de contrôle FPLC
Astra	Technologie Wyatt		Logiciel d’acquisition et d’analyse de données MALS
Albumine sérique bovine (pureté >97 %)	sigma	A1900	Analyte
DAWN ou miniDAWN	Technologie Wyatt	WH2 ou WTREOS	WH2 ou WTREOS
Augmentation 200 10/300	GE Soins de santé		Colonne d’exclusion de taille, pores de 200 Å, 10 mm de diamètre intérieur, longueur de 300 mm
OptiLab	Technologie Wyatt	WTREX	Détecteur d’indice de réfraction différentiel (IR)
Chlorure de sodium NaCl	sigma	Référence 71382	NaCl de qualité HPLC
Filtre pour bouteille Stericup polyéther sulfone 0,1 μm 1000 mL	Millipore	Millipore	Filtre de phase mobile
Whatman Anotop 10 filtre seringue 0,02 μm	GE Soins de santé	Référence 6809-1002	Exemple de filtre
Filtre à pointe de seringue Whatman Anotop 10, pore de 0,1 μm, diamètre 10 mm G	GE Soins de santé	Référence 6809-1012	Exemple de filtre
Whatman Anotop 25 filtre seringue 0,1 μm	GE Soins de santé	Référence 6809-2012	Filtre de phase mobile
WyattQELS	Technologie Wyatt	WIQ	Détecteur dynamique de diffusion de la lumière