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1. Préparation du système
- Connectez les détecteurs MALS et dRI en aval du détecteur UV du FPLC. Contournez les détecteurs de pH et de conductivité car ils ajouteront un volume inter-détecteurs significatif entre les détecteurs UV et MALS. Utilisez un tube capillaire de 0,25 mm de diamètre intérieur de la colonne vers et entre les détecteurs, et un tube capillaire de 0,75 mm de diamètre intérieur à la sortie des détecteurs vers le collecteur de déchets ou de fractions.
- Assurez-vous que les connexions de signal nécessaires entre le FPLC et les détecteurs ont été établies, y compris la sortie analogique du détecteur UV vers l'entrée analogique MALS, et la sortie numérique du FPLC vers l'auto-injection MALS, via le boîtier d'E/S du FPLC.
- Installer une colonne analytique SEC appropriée couvrant une plage de fractionnement d’au moins 20 kDa à 500 kDa. Vérifiez les informations sur le produit pour déterminer si la colonne est adaptée à la plage de MW, de pH et d’autres propriétés de l’échantillon et de la phase mobile.
2. Préparation du tampon, rinçage du système pendant la nuit et vérification de la propreté
- À l’aide de réactifs de qualité HPLC, préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate avec 50-100 mM de NaCl. Filtrez le tampon à 0,1 μm à l’aide d’un filtre polyéther sulfone ou similaire. Filtrez les premiers 50 à 100 ml de tampon dans une bouteille de déchets et jetez-les, afin d’éliminer les particules des filtres secs, puis filtrez le reste dans une bouteille propre et stérile qui a été soigneusement lavée avec de l’eau filtrée et désionisée et bouchée pour empêcher la poussière de pénétrer.
note: D’autres solvants en phase mobile, tels qu’un tampon Tris, peuvent être utilisés si des protéines supplémentaires qui sont dissoutes préférentiellement dans ces solvants doivent être analysées.
- Rincer pendant la nuit à un débit de 0,5 mL/min, ou selon les recommandations du fabricant de la colonne, pour équilibrer la colonne dans le tampon et éliminer les particules. Utilisez le mode d'écoulement continu du FPLC et assurez-vous que le flux ne s'arrête pas tant que tous les cycles SEC-MALS ne sont pas terminés.
- Placez la cellule d’écoulement dRI en mode Purge pendant la nuit. Désactivez la purge avant de commencer les exécutions d’échantillons.
- Au début du rinçage, augmentez progressivement le débit pour éviter l’effet de « perte de colonne » (ou libération de particules) causé par un changement soudain de pression dans la colonne.
- Si le système est connu pour être assez stable et exempt de particules, et en équilibre avec la phase mobile souhaitée, remplacez le rinçage de nuit par un rinçage plus court, de 2 à 3 heures.
- Vérifiez la propreté du système en tapotant légèrement le tube en aval de la colonne pour libérer les particules accumulées et en observant le signal dans le détecteur à 90° sur l’écran du panneau avant de l’instrument MALS. Vérifiez que le bruit crête à crête ne dépasse pas 50 -100 μV.
- Effectuez une injection à blanc pour vérifier que l'injecteur est exempt de particules. Un « blanc » est simplement le tampon courant, préparé dans un flacon frais et stérile.
- Si le pic de particules n’est pas supérieur à 1 mL et supérieur de 5 mV à la ligne de base, le système est prêt pour les échantillons. Sinon, effectuez des injections supplémentaires à blanc jusqu’à ce qu’elles soient propres, ou effectuez un entretien pour nettoyer l’injecteur.
3. Préparation et chargement de l’échantillon
- Préparez au moins 200 μL de BSA à 1-2 mg/mL dans le tampon SEC.
note: Afin d’éviter les précipitations, le BSA ne doit jamais être dissous dans de l’eau pure.
- Filtrez la protéine à 0,02 μm à l’aide d’un filtre à l’extrémité d’une seringue.
- Jetez les premières gouttes de filtrat afin d’éliminer les particules des filtres secs.
- Vous pouvez également centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 15 minutes pour permettre la précipitation d’agrégats non solubles et d’autres grosses particules.
- Injecter 100 μL de la solution BSA dans le loop.
note: Il s’agit de la quantité recommandée de matériau, et plus ou moins peut être injectée en fonction des circonstances de l’échantillon, telles que la stabilité ou la disponibilité. La quantité de protéines nécessaire par injection varie inversement avec le poids moléculaire : deux fois plus de masse protéique est nécessaire si le poids moléculaire est de 33 kDa ou la moitié de celui de BSA.
4. Préparation du logiciel MALS
- Ouvrir Nouveau | Expérimentez à partir de la méthode dans le menu du logiciel MALS et sélectionnez la méthode en ligne dans le dossier des méthodes du système de diffusion de la lumière. Si un détecteur DLS est présent, sélectionnez la méthode en ligne dans la section Diffusion de la lumière | Avec dossier QELS.
- Dans la section Configuration, définissez les paramètres de l’échantillon et de la phase mobile.
- Dans la vue Pompe générique, définissez le débit sur celui utilisé dans le FPLC.
- Dans la vue Pompe générique, branche Solvant, champ Nom, sélectionnez PBS.
- Dans la vue Injecteur, branche Échantillon, entrez le nom BSA et définissez dn/dc = 0,185 (valeur standard pour les protéines non modifiées), A2 = 0 et coefficient d’extinction UV = 0,667 mL/(mg-cm).
note: Pour d’autres protéines, le coefficient d’extinction UV280 nm peut être trouvé dans la littérature ou calculé à partir de sa séquence à l’aide de divers outils logiciels du domaine public.
- Dans la section Procédures, vue Collection de base, cochez la case Déclencheur lors de l’injection automatique et définissez la durée de l’exécution sur 70 min afin que les données soient collectées pour l’ensemble de l’élution jusqu’à ce que le volume de perméation total de la colonne SEC soit atteint.
note: Le temps nécessaire peut varier en fonction de la colonne et du débit - 35 min de collecte sont nécessaires pour une colonne HPLC-SEC standard de 7,8 mm x 300 mm à 0,5 mL/min.
- Démarrez l’expérience dans le logiciel MALS en cliquant sur le bouton Exécuter. Il commencera à lire les données après avoir reçu le signal d’impulsion de l’instrument FPLC via le détecteur MALS.
- Mettez à zéro le signal dRI en cliquant sur le bouton Autozero sur le panneau avant de l'instrument.
5. Préparation du logiciel FPLC
- Insérez le nom de la protéine et de l’exécution dans le logiciel FPLC, dans Manuel | Exécuter des instructions manuelles | Marquer.
- Basculez la vanne d’injection de la charge manuelle à l’injection sous le chemin d’écoulement | Soupape d’injection.
- Inclure un signal d’impulsion en insérant une impulsion de 0,5 s sous le boîtier d’E/S | Sortie numérique par impulsion. Cela déclenchera la collecte de données dans le logiciel MALS.
6. Injectez l’échantillon dans la boucle. Cliquez sur Exécuter dans le logiciel FPLC pour démarrer l’exécution de l’expérience.