Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire pour isoler deux protéines en interaction

Résumé

Source : Hastings, J. F. et al. Dissection de complexes de signalisation multiprotéiques par purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous avons démontré la purification par affinité de complémentation bimoléculaire, BiCAP, pour détecter et isoler des dimères protéiques spécifiques à l’aide d’anticorps à domaine unique spécifiques à la conformation.

Protocole

1. Culture cellulaire et transfection

REMARQUE : Pour la transfection des vecteurs BiFC, il est important d’obtenir une transfection à haut rendement et relativement homogène. Les vecteurs seront probablement compatibles avec n’importe quel réactif de transfection standard, et les conditions de transfection doivent être optimisées en conséquence. Pour effectuer la spectrométrie de masse, nous cultivons généralement des cellules dans des boîtes de 10 cm, bien que cela puisse également être réduit proportionnellement à des boîtes ou des plaques plus petites pour les expériences qui nécessitent moins de matériel.

1. Grainez 1,0 × 10⁶ cellules HEK293T dans une boîte de 10 cm avec 10 ml de milieu DMEM, complété par 10 % de FBS et de pénicilline/streptomycine (1:100).
2. Diluer 2,5 μg de chaque vecteur BiFC dans 500 μL de tampon de transfection (voir le tableau des matériaux) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
3. Ajouter 10 μL de réactif de transfection (voir tableau des matériaux).
4. Mélange de vortex pendant 10 s, puis centrifuger brièvement. Incuber 10 min à température ambiante.
5. Ajouter le mélange de transfection d’ADN dans la plaque, goutte à goutte. Incuber les cellules pendant une durée suffisante pour que les protéines de fusion BiFC interagissent et pour le repliement de Vénus et la maturation des fluorophores, généralement ~8 - 24 h.
   REMARQUE : L’excitation maximale de Vénus est de 515 nm et son émission maximale est de 528 nm, bien que cela soit facilement visualisé à l’aide d’un microscope fluorescent standard configuré pour visualiser la fluorescence GFP.

2. Préparation des échantillons

1. Récolte des lysats
   1. Avant le prélèvement du lysat, préparer le tampon de lyse cellulaire [50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 1 % (v/v) de détergent non ionique (voir le tableau des matériaux)]. Conserver à 4 °C.
   2. Immédiatement avant le prélèvement, compléter 10 ml de tampon de lyse cellulaire avec un inhibiteur de la protéase et un inhibiteur de la phosphatase (voir le tableau des matériaux). Conservez le tampon de lyse cellulaire supplémenté sur de la glace.
   3. Lavez les cellules deux fois dans du PBS glacé. Aspirez le PBS et ajoutez 1 ml de tampon de lyse cellulaire complété par de la glace. Placez le plat sur de la glace, en veillant à ce que le tampon soit réparti sur toute la surface.
   4. Incuber sur de la glace pendant environ 5 minutes, puis utiliser un grattoir à cellules (voir le tableau des matériaux) pour racler les cellules et les transférer dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi de 1,5 ml.
   5. Éliminer les débris cellulaires en centrifugeant le lysat collecté à 18 000 × g pendant 5 min à 4 °C et transférer le surnageant éliminé dans des tubes de microcentrifugation frais.
      note: À ce stade, le lysat peut être utilisé immédiatement ou stocké à -80 °C. Il est également recommandé de conserver une aliquote de lysat brut afin de valider l’efficacité de la transfection et de la purification par affinité.
2. Purification par affinité
   note: L’étape d’isolement BiCAP est réalisée à l’aide du nanocorps GFP conjugué à des billes d’agarose (voir Tableau des matériaux).
   1. Préparez les billes d’agarose en lavant un volume approprié (20 μL par échantillon + 10 μL d’excès) dans 1 mL de PBS. Centrifugez les billes à 300 x g et retirez le surnageant.
   2. Ajouter 20 μL à chaque échantillon de lysat.
   3. Incuber les échantillons pendant 2 h à 4 °C avec rotation de bout en bout.
      note: À ce stade, les échantillons peuvent être préparés soit pour SDS-PAGE et western blot, soit pour une analyse par spectrométrie de masse.
3. Préparation de l’éluant BiCAP pour le western blot.
   1. Centrifugez les billes à 300 x g et lavez-les trois fois dans le tampon de lyse cellulaire.
   2. Remettre les billes lavées en suspension dans 50 μL de tampon d’échantillon correctement dilué (voir tableau des matériaux) et chauffer les échantillons à 95 °C pendant 2-3 min
      note: Les échantillons préparés de cette manière peuvent être conservés à -20 °C pendant plusieurs mois.
   3. Effectuez le SDS-PAGE et le western blot pour les balises V1 et V2 (voir la table des matériaux), ainsi que pour toute autre protéine d’intérêt.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Gibco	Référence 11995-073	Culture cellulaire
FBS	Life Technologies Australie	Référence 10099-141	Culture cellulaire
Pénicilline/streptomycine	Life Technologies Australie	Référence 15070-063	Culture cellulaire
Tampon de transfection jetPRIME	Polyplus	114-15	Culture cellulaire
réactif de transfection jetPRIME	Polyplus	114-15	Culture cellulaire
PhosSTOP (inhibiteur de la phosphatase)	Sigma-Aldrich	4906837001	Culture cellulaire
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche	11873580001	Articles en plastique
Racleur de cellules	Sarstedt	Référence 83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek GmbH	GTA-100	Nanocorps GFP couplé à des billes d’agarose
Anticorps monoclonal GFP N-terminal	Covance	MMS-118P	Détectera la balise V1 dans les vecteurs BiFC
Anticorps monoclonal C-terminal GFP	Roche	11814460001	Détectera la balise V2 dans les vecteurs BiFC
Tampon d’échantillonnage	Invitrogen	Réf. NP0008	Complété par 1 mL de β-mercaptoéthanol.
Trypsine modifiée de qualité séquençage	Promega Corporation	V5117h	Culture cellulaire
Tubes à microcentrifuger LoBind	Diagnostic au point d’intervention	Référence 0030 108 116	Articles en plastique
Iodoacétamide	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Préparé à 5 mg/mL dans de l’eau ultrapure
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Cellules DH5α	Thermo Fisher		Cellules capables de résister aux chocs thermiques