Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire pour isoler deux protéines en interaction

Abstract

Source : Hastings, J. F. et al. Dissection de complexes de signalisation multiprotéiques par purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous avons démontré la purification par affinité de complémentation bimoléculaire, BiCAP, pour détecter et isoler des dimères protéiques spécifiques à l’aide d’anticorps à domaine unique spécifiques à la conformation.

Protocol

1. Culture cellulaire et transfection

REMARQUE : Pour la transfection des vecteurs BiFC, il est important d’obtenir une transfection à haut rendement et relativement homogène. Les vecteurs seront probablement compatibles avec n’importe quel réactif de transfection standard, et les conditions de transfection doivent être optimisées en conséquence. Pour effectuer la spectrométrie de masse, nous cultivons généralement des cellules dans des boîtes de 10 cm, bien que cela puisse également être réduit proportionnellement à des boîtes ou des plaques plus petites pour les expériences qui nécessitent moins de matériel....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	Référence 11995-073	Culture cellulaire
FBS	Life Technologies Australie	Référence 10099-141	Culture cellulaire
Pénicilline/streptomycine	Life Technologies Australie	Référence 15070-063	Culture cellulaire
Tampon de transfection jetPRIME	Polyplus	114-15	Culture cellulaire
réactif de transfection jetPRIME	Polyplus	114-15	Culture cellulaire
PhosSTOP (inhibiteur de la phosphatase)	Sigma-Aldrich	4906837001	Culture cellulaire
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche	11873580001	Articles en plastique
Racleur de cellules	Sarstedt	Référence 83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek GmbH	GTA-100	Nanocorps GFP couplé à des billes d’agarose
Anticorps monoclonal GFP N-terminal	Covance	MMS-118P	Détectera la balise V1 dans les vecteurs BiFC
Anticorps monoclonal C-terminal GFP	Roche	11814460001	Détectera la balise V2 dans les vecteurs BiFC
Tampon d’échantillonnage	Invitrogen	Réf. NP0008	Complété par 1 mL de β-mercaptoéthanol.
Trypsine modifiée de qualité séquençage	Promega Corporation	V5117h	Culture cellulaire
Tubes à microcentrifuger LoBind	Diagnostic au point d’intervention	Référence 0030 108 116	Articles en plastique
Iodoacétamide	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Préparé à 5 mg/mL dans de l’eau ultrapure
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Cellules DH5α	Thermo Fisher		Cellules capables de résister aux chocs thermiques