1. Préparation des échantillons
- Purifier la biomolécule souhaitée.
note: Ce protocole utilise l’aptamère d’ADN de liaison à la cocaïne MN4 acheté après trois échanges contre du NaCl 2 M, suivis de trois cycles d’eau désionisée à l’aide d’un filtre centrifuge avec une membrane de coupure de poids moléculaire de 3 kDa.
- Synthétisez et purifiez, ou achetez le ligand thermolabile souhaité.
note: MN4 lie le ligand thermolabile cocaïne. MN4 se lie également à la quinine, qui est utilisée comme contrôle négatif pour la thermolabilité du ligand à ces températures expérimentales.
- Préparez des tampons pour la dialyse de la biomolécule purifiée et la dissolution des ligands (20 mM de phosphate de sodium et 140 mM de tampon NaCl, pH 7,4, pour MN4 et les ligands utilisés ici).
- Dialyser la biomolécule contre au moins 2 L de tampon à l’aide d’une tubulure de dialyse avec une coupure de 0,5 à 1,0 kDa.
- Filtrez le tampon final (appelé tampon de travail) à travers un filtre de 0,2 μm qui a été soigneusement équilibré avec le tampon.
- Pesez les masses souhaitées de ligands et dissolvez-les dans un tampon de travail filtré. Si les concentrations de ligands souhaitées nécessitent des masses trop petites pour être pesées avec précision, préparez une solution mère de ligand concentrée (10x par exemple).
note: Il est crucial que toutes les expériences DSC utilisent le même tampon de travail pour l’échantillon et le ligand, c’est-à-dire qu’elles n’effectuent jamais une expérience où le ligand est dissous dans un lot de tampon de travail différent de celui de la biomolécule, car cela provoquerait des artefacts de non-concordance du tampon dans les données.
- Filtrez la solution mère de biomolécule à travers un filtre de 0,2 μm qui a été soigneusement équilibré avec le tampon de travail.
- Déterminer la concentration de la biomolécule par des mesures d’absorbance (260 nm pour les acides nucléiques comme MN4 et 280 nm pour les protéines).
- Conservez la biomolécule et le ligand préparés dans un réfrigérateur à 4 °C (adapté pour MN4 et les ligands utilisés ici), ou à -20 ou -80 °C si la biomolécule et les ligands tolèrent la congélation et qu’un stockage à long terme est nécessaire. Dégazer les solutions tampon, biomoléculaires et ligands dans un dégazeur de table (voir le tableau des matériaux) avant de les charger dans le DSC.
note: Le dégazage permet d’éviter la formation de bulles dans le DSC à des températures plus élevées. Les bulles provoquent des artefacts de signal qui masquent les formes de pic et les lignes de base DSC.
2. Préparation DSC
- Dévissez la poignée de pression du DSC (voir tableau des matériaux).
- Faites passer le tube en silicone à partir du tampon de travail et fixez-le à la bride avant (ouverture métallique) du capillaire de référence.
- Créez un pont entre les capillaires de référence et d’échantillon en connectant la bride de référence arrière à la bride d’échantillon avant.
- Fixez un morceau de tube en silicone à la bride d’échantillon arrière qui va vers une fiole à déchets avec une conduite de vide attachée.
- Allumez la conduite d’aspiration pour rincer le DSC avec 200 ml de tampon de travail.
- Chargez le capillaire de référence du DSC avec le tampon de travail. Fixez des sections d’environ 3 à 5 cm de tube en silicone aux brides capillaires de référence.
- Insérez une pointe de pipette de 1 ml dans le tube en silicone de la bride arrière. Prélevez 0,8 ml de tampon de travail à l'aide d'une pipette et insérez la pointe de la pipette avec le tampon dans le tube en silicone de la bride de référence avant.
- Appuyez doucement sur le piston de la pipette pour faire passer le tampon de travail à travers le tube en silicone avant dans le capillaire de référence et vers le haut dans la pointe de pipette attachée à la bride arrière. Appuyez sur le piston de la pipette jusqu’à ce que le niveau du tampon de travail atteigne juste au-dessus du tube en silicone avant, puis relâchez le piston de la pipette jusqu’à ce que le niveau du tampon de travail atteigne juste au-dessus du tube en silicone arrière.
- Répétez l’opération en passant le tampon de travail d’avant en arrière pour purger le volume dans le capillaire de référence des bulles.
note: Habituellement, 10 passages de la solution dans les deux sens sont suffisants pour éliminer les bulles.
- Fermez la pointe arrière de la pipette avec le pouce et tirez doucement sur la pointe arrière de la pipette et la pipette avant pour les retirer des brides de référence avec le tube en silicone attaché.
- Chargez le capillaire de l’échantillon avec le tampon de travail comme aux étapes 2.6 à 2.9. Placez un capuchon en plastique noir sur la référence arrière et les brides d’échantillonnage, en laissant les brides avant découvertes.
- Fixez la poignée de pression.
- Ouvrez le logiciel DSC (voir Tableau des matériaux) et mettez l’instrument sous pression en cliquant sur la flèche rouge vers le haut en haut de l’interface une fois que la puissance est stabilisée ; la puissance DSC est indiquée dans une case en haut à droite de l’interface avec la lecture de la température et de la pression de l’instrument.
note: Surveillez la lecture de la puissance à mesure que le DSC met en pression. Les changements de puissance de plus de ~ 10 μW indiquent la formation de bulles dans les capillaires, ce qui peut provoquer des artefacts dans les données. Les solutions doivent être retirées et dégazées davantage avant de continuer.
- Équilibrez le DSC avec la mémoire tampon de travail en effectuant un balayage avant et arrière. Dans l’onglet « Méthode expérimentale » sur le côté gauche de l’écran, assurez-vous que l’option « Balayage » est sélectionnée pour exécuter le DSC en mode de balayage de température.
note: Les paramètres expérimentaux sont la plage de balayage de température, la vitesse de balayage, le temps d’équilibrage à basse et haute température et le nombre de balayages.
- Dans l’encart « Paramètres de température » sous l’onglet « Méthode expérimentale », cliquez sur le bouton « Chauffage ». Entrez 1 et 100 °C pour les températures expérimentales inférieure et supérieure, 1 °C/min pour la vitesse de balayage et 60 s pour la période d’équilibration.
- Cliquez sur le bouton « Ajouter une série » sous le champ de saisie de la période d’équilibrage. Entrez 2 dans le champ « Étapes à ajouter » dans la fenêtre contextuelle (pour un balayage de chauffage et un balayage de refroidissement) et cochez la case « Chauffage / refroidissement alternatif ». Cliquez sur « OK » ; Les numérisations ajoutées apparaissent dans la partie inférieure de l’interface. Vérifiez que les paramètres de chaque balayage sont ceux souhaités.
- Démarrez l’expérience en cliquant sur le bouton vert « jouer » en haut de l’interface. Naviguez jusqu’au dossier souhaité et entrez un nom de fichier pour enregistrer l’expérience dans la fenêtre contextuelle. Affichez la progression de l’expérience en cliquant sur l’onglet « Données » à droite de l’onglet « Méthode de l’expérience ».
3. Collecte des ensembles de données DSC de ligands thermolabiles
REMARQUE : La procédure minimale consiste en cinq expériences : des expériences de référence de tampon avec et sans ligand (utilisé pour la soustraction de la ligne de base), des expériences d’échantillons avec la biomolécule libre, la biomolécule liée au ligand et la biomolécule liée au ligand avec une période d’équilibrage à haute température plus longue.
- Exécutez des expériences de référence pour la soustraction de la ligne de base des données de l’échantillon. Chargez le DSC avec le tampon de travail dans les deux capillaires et effectuez plusieurs balayages avant et arrière sur une plage de température appropriée à 1 °C min-1 avec un temps d’équilibrage supérieur (haute température) de 120 s.
- Supprimez les analyses d’équilibrage de la mémoire tampon précédentes de la partie inférieure de l’interface en les mettant en surbrillance individuellement et en cliquant sur le X rouge au milieu à droite de l’interface. Ajoutez les nouveaux numérisages en cliquant sur le bouton « Ajouter une série », en entrant 20 dans le champ « Étapes à ajouter » et en cochant la case « Chauffage/Climatisation alternatif ». Cliquez sur OK et lancez l’expérience en cliquant sur le bouton vert de lecture comme ci-dessus.
- Répéter les étapes 3.1 et 3.1.1 avec le tampon de travail contenant la concentration souhaitée de ligand dans les deux capillaires pour obtenir les expériences de référence pour le ligand (recueillir deux expériences distinctes en utilisant respectivement des temps d’équilibrage à haute température de 120 s et 600 s, à utiliser pour obtenir la constante de vitesse pour la conversion du ligand thermolabile).
note: La vitesse de balayage utilisée ici garantit que la biomolécule dans les expériences ultérieures est à l’équilibre thermique dans les balayages avant et arrière. Des vitesses de balayage < 0,1 à 0,2 °C min-1 entraînent des thermogrammes bruyants et ne sont pas applicables dans les expériences DSC. Les températures doivent s’étendre bien en dessous de la température de fusion de la biomolécule libre à bien au-dessus de la température de fusion de la biomolécule saturée de ligands (~ 20 - 80 °C pour MN4). Vérifiez la reproductibilité des balayages (par exemple, 10 balayages avant et 10 balayages arrière pour un total de 20 suffisent).
- Si vous utilisez plusieurs ligands (comme la cocaïne et la quinine), rincez la DSC avec 200 ml de tampon de travail (répétez l’opération à partir de l’étape 2.5) entre les passages afin d’éliminer les ligands des capillaires et d’éviter la contamination croisée.
note: Il est utile d’effectuer une expérience répétée sur la biomolécule libre après un passage lié au ligand afin de vérifier si le ligand précédent s’adsorbe fortement sur les parois capillaires et n’est pas éliminé de manière adéquate avec le rinçage tampon. Si les thermogrammes de la biomolécule libre semblent être décalés à une plus grande amplitude et à une température de dénaturation plus élevée après l’expérience liée au ligand, il est probable que le ligand précédent soit toujours présent dans le calorimètre après le rinçage. Retirez le ligand adsorbé en incubant les capillaires avec 20 % de Contrad-70 pendant 1 h à 60 °C avec les capuchons en plastique et la poignée de pression retirés. Dans le logiciel DSC, changez le mode expérimental en « Isotherme » sous l’onglet Méthode Expérimentale. Choisissez 3 600 s pour la durée et 60 °C pour la température isotherme, avec zéro saisi pour le temps d’équilibre. Cliquez sur « Ajouter à la méthode expérimentale ». L’expérience isotherme apparaît dans la partie inférieure de l’écran. Une fois terminé, rincez l’instrument avec 2 L d’eau déminéralisée et répétez l’opération à partir de l’étape 2.5.
- Exécutez des expériences d’échantillonnage en utilisant la même procédure de chargement DSC et les mêmes paramètres expérimentaux que les balayages de référence. Pour l’ensemble de données sur la biomolécule libre, assurez-vous que le capillaire de référence contient le tampon de travail tandis que le capillaire de l’échantillon contient la biomolécule libre à la concentration souhaitée dans le tampon de travail.
- Pour les expériences liées au ligand, assurez-vous que le ligand se trouve dans le tampon de travail du capillaire de référence, et que la biomolécule plus le ligand se trouvent dans le tampon de travail dans le capillaire de l’échantillon. Rincez le système entre les ajouts de différents ligands comme à l’étape 2.5.
- Effectuer une expérience supplémentaire avec la biomolécule liée au ligand thermolabile où la période d’équilibre à haute température est portée à 600 s et tous les autres paramètres expérimentaux sont les mêmes qu’à l’étape 3.2.1.
note: La durée de la période d’équilibrage à haute température pour la deuxième expérience liée au ligand est simplement choisie pour s’assurer que le ligand s’appauvrit plus rapidement que l’expérience à temps d’équilibre court. Si les pics liés au ligand de la première expérience décroîtissent lentement en fonction du nombre de balayage (par exemple, les différences entre les maxima de pics successifs sont ≤ 0,5 °C), estimez les augmentations de 10 à 20 fois de la période d’équilibre à haute température afin d’appauvrir correctement le ligand au cours de la deuxième expérience. Le calcul précis de la constante de vitesse pour la conversion du ligand exige que la deuxième expérience ait un appauvrissement plus rapide du ligand par rapport à la première. Les concentrations de ligands extraites de l’analyse globale des deux expériences seront similaires et donc inutilisables si l’appauvrissement des ligands n’est pas suffisamment accéléré dans la deuxième expérience.
4. Traitement des données
- Ouvrez les fichiers d’expérience DSC dans le logiciel d’analyse de données DSC (voir Table des matériaux) et exportez les données de puissance brutes sous forme de feuilles de calcul.
- Importez les feuilles de calcul contenant les données d’alimentation brutes dans le logiciel d’ajustement des données.
- Soustraire les données de l’échantillon en soustrayant les données de puissance tampon des expériences sur les biomolécules libres et liées aux ligands.
note: Pour l’expérience du ligand thermolabile, la concentration du ligand initial diminue à chaque balayage. Par conséquent, il est idéal de soustraire le balayage de la mémoire tampon 1 du balayage de l’échantillon 1, et ainsi de suite. Nous avons constaté que les scans tampons avec la cocaïne ne changent pas sensiblement au fur et à mesure que la conversion du ligand se poursuit et qu’un seul balayage tampon du ligand thermolabile peut donc être utilisé pour soustraire toutes les données liées au ligand thermolabile.
- Convertissez les données de puissance de l’échantillon soustraites de référence en capacité thermique.
note: La conversion nécessite le volume spécifique partiel de la biomolécule, qui peut être estimé.
5. Analyse des données
- Ajustez globalement l’ensemble de données sur la capacité thermique liée au ligand thermolabile à temps d’équilibrage court avec un seul ensemble de paramètres de référence, de concentration de ligand, de repliement et de liaison de ligand.
- Répétez l’ajustement global pour l’ensemble de données de temps d’équilibrage long afin de calculer la constante de vitesse pour la conversion des ligands thermolabiles.
